不同廠家復方丹參片抑菌作用強弱的比較

王海華

(廣西南寧食品藥品檢驗所，廣西南寧530001)

復方丹參片收載在《中國藥典》2005年版一部［1］，含丹參、三七、冰片3種中藥成分，具有活血化瘀，理氣止痛的功效。處方中丹參和冰片兩味中藥材，均對某些細菌的生長繁殖有一定抑制作用［2-6］。為保證臨床用藥的安全性，目前各國藥典對口服制劑的微生物污染狀況有明確的質控指標［1，7-10］。在藥品監督檢驗工作中，經常遇到該品種不同生產廠家提供的微生物限度檢查資料所采用的方法差異很大，本實驗通過回收率實驗對16個廠家生產的復方丹參片的抑菌作用強弱進行了比較，為該品種的微生物限度檢驗方法的建立提供參考和依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 SPS202F電子天平［奧豪斯國際貿易(上海)有限公司］;TDL-40B臺式離心機(上海安亭科學儀器廠);LRH-250-G型光照培養箱(廣東省醫療器械廠);LRH-250-A型生化培養箱(廣東省醫療器械廠);HR-8753GM微波爐(青島海爾微波制品有限公司);Ⅱ級生物安全柜(上海振梓創空氣凈化設備有限公司)等。

1.2 實驗菌種 枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)［CMCC(B)63501］、金黃色葡萄球菌(Staphlococcus aureus)［CMCC(B)26003］、大腸埃希菌(Escherichia coli)［CMCC(B)44102］、白色念珠菌(Candida albicans)［CMCC(F)98001］、黑曲霉(Aspergillus niger)［CMCC(F)98003］，由中國醫學微生物菌種保藏管理中心提供。

1.3 培養基及稀釋劑 營養瓊脂培養基，玫瑰紅鈉瓊脂培養基，營養肉湯培養基，膽鹽乳糖培養基(BL)，改良馬丁培養基，MUG培養基，曙紅亞甲藍瓊脂培養基，膽鹽乳糖發酵培養基，pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液，0.9%無菌氯化鈉溶液。

1.4 樣品 復方丹參片，16個廠家生產(編號分別為 A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、K、L、M、N、O、P)，從市場購買。

2 方法［1］

2.1 菌液的制備 取經35℃培養18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營養肉湯培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液，備用;取經25℃培養24～48 h的白色念珠菌液體培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液，備用;取經25℃培養1周的黑曲霉斜面培養物，加10 mL 0.9%無菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子，吸取菌液用0.9%無菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數為50～100 cfu的菌懸液，備用。

2.2 供試液制備 取樣品10 g，加pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液稀釋至100 mL，制備成溶解均勻的1∶10的供試液。

2.3 采用方法

2.3.1 常規法 取1∶10的供試液1 mL注皿。

2.3.2 培養基稀釋法 取1∶10的供試液1mL注入2個平皿(0.5 mL/皿)或5個平皿(0.2 mL/皿)。

2.3.3 低速離心法加培養基稀釋法 取1∶10供試液10 mL至無菌離心管中，500 r/min離心5 min，取上清液1 mL分別注入2個平皿(0.5 mL/皿)或5個平皿(0.2 mL/皿)。

2.3.4 低速離心法加薄膜過濾法 取1∶10供試液10 mL至無菌離心管中，500 r/min離心5 min，取上清液1 mL 薄膜過濾，沖洗 100、200、300、400、500 mL。

3 回收率測定

3.1 試驗組 按2.3項下方法操作后，分別加入試驗菌50～100 cfu注入同一平皿中，立即傾注瓊脂培養基，待凝固后，置規定溫度，細菌培養24～48 h，白色念珠菌和黑曲霉培養48～72 h，測定其菌數(薄膜過濾法取上述供試液過濾、沖洗，在最后一次沖洗液中加入試驗菌50～100 cfu，過濾，按薄膜過濾法測定其菌數)。

3.2 菌液組 取試驗菌50～100 cfu注入平皿中，立即傾注瓊脂培養基，其余操作同3.1項。

3.3 供試品對照組 按2.3項下方法操作后，立即傾注瓊脂培養基，其余操作同3.1項。

3.4 稀釋劑對照組 取pH7.0無菌氯化鈉-白胨緩沖液1mL和試驗菌50～100 cfu，分別注入同一平皿中。考察稀釋劑對試驗有無干擾。該對照組各試驗菌的回收菌應不低于70%。

試驗組的加菌回收率(%)=(試驗組平均菌落數-供試品對照組平均菌落數)/(菌液組的平均菌落數)×100%。

稀釋劑對照組的加菌回收率(%)=(稀釋劑對照組的平均菌落數)/(菌液組的平均菌落數)×100%。

4 結果

4.1 預試驗結果 按照藥典規定的5種試驗菌，采用常規法測定16個廠家生產的復方丹參片的回收率，以確定敏感菌株。預試驗結果見表1。

表1所見，16個廠家生產的復方丹參片，金黃色葡萄球菌采用常規法回收率幾乎全部為0，表明復方丹參片對細菌抑制作用明顯，確定細菌數測定選用金黃色葡萄球菌作為敏感菌株進行預試驗。黑曲霉的回收率均大于70%，而白色念珠菌有6個廠家的回收率小于70%，故確定霉菌、酵母菌數測定選用白色念珠菌作為敏感菌株進行預試驗。

4.2 細菌數測定方法的確定 根據預試驗結果，選用金黃色葡萄球菌作為敏感菌株進行試驗，以確定細菌數測定方法。按2.3項下操作，結果見表2。

由表2結果得出:要達到藥典規定回收率大于70%的要求，不同廠家生產的復方丹參片需采用不同的方法:

編號E、F、G、O，需采用培養基稀釋法(0.2 mL/皿);編號K，需采用低速離心加培養基稀釋法0.5 mL/皿;編號 D、H、L、M、N，需采用低速離心加培養基稀釋法0.2 mL/皿;編號C、J，需采用低速離心加薄膜過濾法100 mL、編號B需200 mL、編號 P需300 mL;編號I，需采用薄膜過濾法(1∶100供試液1 mL過濾)100 mL、編號A需200 mL。

表1 十六個廠家復方丹參片常規法預試驗結果(n=3)

pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液作為稀釋劑的稀釋劑對照組回收率超過70%，表明稀釋劑pH7.0無菌氯化鈉—蛋白胨緩沖液無抑菌作用，對實驗無干擾。

4.3 霉菌和酵母菌數測定方法的確定 根據預試驗結果，選用白色念珠菌作為敏感菌株進行試驗，以確定霉菌和酵母菌數測定方法。按2.3項下操作，結果見表3。

編號 E、F、G、J、K、L、M、N、O、P 共 10 個廠家生產的復方丹參片，白色念珠菌采用常規法回收率大于70%;編號B、D、H采用培養基稀釋法0.5 mL/皿，編號 A、C、I需0.2 mL/皿其回收率也均大于70%。

4.4 細菌、霉菌及酵母菌計數方法驗證 根據預試驗及細菌，霉菌、酵母菌方法確定結果，取16個廠家生產的復方丹參片樣品，按藥典規定進行5種試驗菌的加菌回收率試驗驗證。

細菌計數:

編號為E、F、G、O廠家的復方丹參片采用培養基稀釋法(0.2 mL/皿);編號為 D、H、L、M、N 采用低速離心加培養基稀釋法(0.2 mL/皿);編號為K采用低速離心加培養基稀釋法(0.5 mL/皿);編號為C、J、B、P采用低速離心加薄膜過濾法(分別為100 mL、200 mL、300 mL);編號為 A、I采用薄膜過濾法(1∶100供試液1 mL過濾，分別沖洗200 mL、100 mL)。

表2 敏感菌株(金黃色葡萄球菌)回收率試驗結果(n=3)

表3 敏感菌株(白色念珠菌)試驗結果(n=3)

表4 16個廠家復方丹參片驗證方法試驗結果(n=3)

霉菌及酵母菌計數:

編號為 E、F、G、J、K、L、M、N、O、P 按常規法;編號為A、C、I按培養基稀釋法(0.2 mL/皿);編號為B、D、H按培養基稀釋法(0.5 mL/皿)進行加菌回收率試驗。結果見表4。

16個廠家生產的復方丹參片的方法驗證試驗結果表明，由于其抑菌作用強弱不同，需要分別采用不同的方法進行細菌數測定、霉菌及酵母菌數測定，5種規定試驗菌的回收率均大于70%，符合《中國藥典》的規定，方法可行。

4.5 控制菌檢查方法的驗證試驗結果 按藥典方法，分別取16個廠家樣品的1∶10供試液10 mL和1 mL含10～100 cfu的大腸埃希菌加入100 mL BL增菌液(常規法)進行控制菌大腸埃希菌驗證試驗;1∶10供試液1 mL和1 mL含10～100 cfu的大腸埃希菌加入10 mL膽鹽乳糖發酵培養管中(常規法)進行控制菌大腸菌群驗證試驗，同時做相應的陰性對照菌驗證試驗。結果為樣品試驗組都檢出大腸埃希菌、陰性菌對照組都未檢出金黃色葡萄球菌，表明16個廠家的樣品控制菌檢查方法驗證試驗成立，實驗中同時取1∶10供試液10 mL或1 mL按常規法進行控制菌檢查，均未檢出大腸埃希菌和大腸菌群。

5 討論

5.1 在實驗過程中，采用常規法檢查時，16個廠家生產的復方丹參片供試品對照組均無菌生長，當采用培養基稀釋法和薄膜過濾法檢查時，一些本身染菌的樣品在供試品對照組中檢出染菌數。可見，在試驗條件下不能有效地排除其抑菌作用，就無法檢查出樣品真實的污染菌數，根據2005版《中國藥典》相關規定，細菌、霉菌和酵母菌計數方法驗證的回收率應不低于 70%［1］附錄71。從表1 ～3 可見，不同廠家生產的復方丹參片對細菌和霉菌的抑菌作用強弱不同，需要采用不同的方法去消除其抑菌作用，才能有效檢出該藥品污染存活的細菌數量。

5.2 從表2結果看出，16個廠家生產的復方丹參片，有4個廠家采用培養基稀釋法，6個廠家采用低速離心加培養基稀釋法，4個廠家采用低速離心加薄膜過濾法，另2個廠家采用薄膜過濾法(1∶100的供試液)，金黃色葡萄球菌的回收率才能大于70%。復方丹參片收載在《中國藥典》2005版一部，處方有丹參、三七、冰片3種中藥，其中丹參、冰片有抑菌作用，其處方、工藝已確定。從實驗結果得出，不同廠家生產的復方丹參片其抑菌強弱不同，尤其是對金黃色葡萄球菌抑菌作用差異顯著，估計主要原因是藥材產地、采收時間不同，丹參的質量也不同。

5.3 編號為A、I廠家生產的復方丹參片由于抑細菌作用太強，上述方法均不能排除其抑菌作用。《中國藥典》規定［11］，若沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用，在不影響檢驗結果判斷的前提下，應采用能使微生物生長的更高稀釋級的供試液進行方法驗證試驗。若驗證試驗符合要求，應以該稀釋級供試液作為最低稀釋級的供試液進行供試品檢驗。考慮到復方丹參片含有原生藥，標準規定細菌數為10 000個/g，在不影響檢驗結果判斷的前提下，將樣品制備成1∶100的供試液，取1 mL進行薄膜過濾。

5.4 由于復方丹參片具有較強的抗菌活性，通過預試驗結果，選擇金黃色葡萄球菌為細菌代表，白色念珠菌為真菌代表進行細菌、霉菌方法確定試驗，既節省了大量人力、物力，又能快速建立有效的微生物限度檢查方法。通常，當藥品生產條件發生改變(如更換產地、更換輔料和改變生產工藝等)或原檢驗條件發生改變時，對微生物限度檢查方法應進行再驗證。由于進行再驗證時，藥品中的活性成分未發生改變，故其抗菌譜也未改變，因此我認為再驗證工作僅需針對藥典規定的全部驗證菌株中的最敏感菌株即可，而不必對全部菌株進行再驗證。采用這種方法，即可保證檢驗方法的有效性，又節省了大量人力、物力，使得驗證工作成為日常檢驗的一部分成為可能。建議藥典逐漸收載各抗菌藥物的最敏感驗證菌株作為質控菌株，方便日常工作。

［1］中國藥典［S］.一部.2005:527-528.

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