HPLC-ELSD測定八珍益母丸中水蘇堿的含量

蔣 歆， 丁永輝， 魏學冰， 楊 錫

(1.蘭州大學藥學院，甘肅蘭州730000;2.甘肅省食品藥品監督管理局，甘肅蘭州730000;3.甘肅省藥品檢驗所，甘肅 蘭州730000)

八珍益母處方源于明代張景岳《景岳全書》，并被解放后歷版《中國藥典》收載。處方由益母草、黨參、白術(炒)、茯苓、甘草、當歸、白芍(酒炒)、川芎、熟地黃組成，用于氣血兩虛兼有血瘀所致的月經不調、月經周期錯后、行經量少、淋漓不凈［1］等癥。其中益母草為君藥，為唇形科植物益母草(Leonurus japonicus Houtt.)的干燥全草，水蘇堿為益母草的主要成分之一，且含量較大。中國藥典對益母草及益母草膏中水蘇堿的含量作為指標成分采用薄層掃描法進行測定［2］，操作煩瑣，誤差較大。本文采用HPLC-ELSD法測定八珍益母丸中水蘇堿的含量，操作簡便、靈敏度高、穩定性及重現性較好，可作為八珍益母丸中水蘇堿含量測定的新方法。

1 儀器與試藥

Waters2695高效液相色譜儀;Waters 2424蒸發光散射檢測器;KQ250B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);德國Sartorius R200D型分析天平(十萬分之一);上海梅特勒AE240型分析天平(萬分之一);鹽酸水蘇堿對照品(購自中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，批號:110712-200508);八珍益母丸(批號為 090310、090311、090312)，乙腈(色譜純，DIKMA公司);水為超純水;其他試劑均為分析純。

2 方法和結果

2.1 色譜條件［3］

色譜柱:Venusil HILIC 柱(4.6 mm ×250 mm，5 μm);流動相:乙腈-0.2%冰醋酸(80∶20);流速:0.5 mL/min;柱溫:35℃，ELSD檢測器:載氣(N2)氣體流速:流速2.8 L/min，飄移管溫度105℃，霧化室溫度:80℃，增益值為135，進樣量10 μL。

2.2 對照品溶液的配制

精密稱取在105℃干燥至恒重的鹽酸水蘇堿12.68 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，制成每1 mL含0.253 6 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取八珍益母丸研細，稱取1 g，置于50 mL三角瓶中，加乙醚30 mL，回流0.5 h，棄去乙醚液，殘渣加乙醇30 mL回流提取30 min，過濾，殘渣及濾器用10 mL乙醇沖洗，濾液置水浴上濃縮約至干，殘渣用乙醇溶解并定容至5 mL，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過，作為供試品溶液。

2.4 陰性對照溶液的制備

根據樣品處方，制備不含益母草的陰性樣品，照供試品溶液的制備項同法操作，即可。

2.5 方法的專屬性考察

在上述色譜條件下，水蘇堿峰與其他成分分離良好，陰性對照樣品試驗，結果表明提取物中其它成分對水蘇堿的測定無干擾，結果見圖1，以水蘇堿峰計算色譜柱的理論板數為8 200。

2.6 線性關系的考察

取對照品溶液 4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、16.0、20.0、30.0 μL分別進樣，按上述色譜條件測定峰面積，以峰面積的對數值為縱坐標，鹽酸水蘇堿對照品(0.253 6 mg/mL)進樣量的對數值為橫坐標(μg)，進行線性回歸，得回歸方程為:lgA=4.729 2+1.005 6lgC，r=0.999 3(n=8)，線性范圍為1.014 4 ～7.608 0 μg。

圖1 八珍益母丸HPLC-ELSD

2.7 精密度試驗

2.7.1 日內精密度

取鹽酸水蘇堿對照品溶液，連續進樣5次，每次進樣10 μL，對峰面積進行考察，RSD為1.52%。

2.7.2 日間精密度

取對照品溶液10 μL進樣，每天進樣兩針，考查3天。測得鹽酸水蘇堿峰面積RSD為1.84%，說明儀器精密度良好。

2.8 重復性試驗

取同一批號的八珍益母丸(批號:090304)，平行取樣6份，按2.3項方法操作并檢測。結果鹽酸水蘇堿平均含量為0.398 8(mg/g)，RSD為1.96%，表明方法重復性良好。

2.9 穩定性試驗

精密吸取0.253 6 mg/mL鹽酸水蘇堿對照品溶液及供試品溶液，于 0、1、2、4、8、12 h 按上述色譜條件分別進樣 20 μL，按鹽酸水蘇堿峰面積計算RSD值分別為0.2%、1.8%，表明對照品溶液和供試品溶液均在12 h內穩定。

2.10 回收率試驗

采用加樣回收法，分別精密稱取已測知含量(批號090304，0.398 8 mg/g)的樣品，按2.3項法操作并檢測。各進樣20 μL，記錄色譜圖，計算回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果(n=6)

2.11 樣品測定

取3批供試品，同2.3項供試品溶液的制備處理 ，制成供試品溶液。分別精密吸取供試品溶液20 μL，對照品溶液5 μL及20 μL注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以外標兩點法對數方程計算樣品中水蘇堿的含量，結果見表2。

表2 樣品的測定結果(n=3)

3 討論

3.1 檢測方法的選擇 取鹽酸水蘇堿對照品溶液進行紫外光譜掃描，結果在201 nm波長處有最大吸收，已低于甲醇等常用流動相的截止波長，不宜用紫外檢測器對其進行檢測，而用通用型蒸發光散射檢測器(ELSD)［4-5］進行檢測可得到較好的分離。

3.2 樣品的提取 八珍益母丸提取物組分復雜，根據水蘇堿不溶于乙醚、氯仿的特性，樣品提取時加乙醚30 mL，回流半小時，棄去乙醚液，除去醚溶性成分，殘渣加乙醇30 mL回流提取30 min，過濾，置水浴上濃縮至干，乙醇定容至5 mL，使樣品得到較好的富集和凈化。

3.3 流動相的選擇 采用不同比例的乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸等多種溶劑系統作為流動相，結果以乙腈-0.2%冰醋酸(80∶20)作為流動相，色譜圖峰型好，出峰時間適宜，分離效果較好。

3.4 試驗中考查不同漂移管溫度、霧化室溫度和氣體流速對測量結果的影響，結果表明在漂移管溫度105℃，霧化室溫度80℃，載氣體積流量2.8 L/min時測量的靈敏度較高，且穩定性較好，故本試驗采用此條件作為測量條件。

3.5 色譜柱選擇［6-7］由于鹽酸水蘇堿極性較大，使用傳統的反相色譜流動相通常在死時間流出而無法得到分離，而親水性色譜柱(HILIC)能為強極性的化合物提供合適的保留，所以本實驗選擇穩定性好的親水性丙基酰胺鍵合硅膠(Venusil-HILIC，100?，4.6 mm ×250 mm，5 μm，VH952505-0)對水蘇堿進行分離，取得了較好的分離效果。

［1］阮金蘭，杜俊蓉，曾慶忠.益母草的化學、藥理和臨床研究進展［J］.中草藥，2003，11(11):15.

［2］中國藥典［S］.一部.2005:312-313.

［3］嚴優芍，李衛民.HPLC法測定益母草不同制劑中水蘇堿［J］.中草藥，2006，37(1)，70-72.

［4］馮 旭，成 智，梁臣艷.HPLC-ELSD測定益母顆粒中鹽酸水蘇堿的含量［J］.中成藥，2008，3(1):2-3.

［5］張彥青，解軍波，張明春，等.HPLC-ELSD法測定酸棗仁滴丸中酸棗仁皂苷A、B和白樺脂酸［J］.中草藥，2009，40(2):234-235.

［6］林冬杰，張會球.HPLC-ELSD法測定益母草流浸膏中鹽酸水蘇堿的含量［J］.亞太傳統醫藥，2009，5(2):45-46.

［7］楊曉云，雪 濤.益母丸中鹽酸水蘇堿成分分析方法的建立［J］.中國現代應用藥學雜志，2008，25(1):69-70.