含油廢水降解菌的篩選及其除油能力實驗

羅曉娟，姜 鵬，侯明明，李 川

（重慶工商大學廢油資源化技術與裝備教育部工程研究中心，重慶400067）

石油是由不同的碳氫化合物混合組成的，隨著社會經濟的發展，石油的使用越來越廣泛，由油液產生的環境的污染日益嚴重。因此減少油液對環境的污染是十分必要的。油液污染的處理方法有機械法、化學法、物理化學法和生物法［1］。而采用生物法減少油液對環境的污染因為其優越性，已經成為研究的熱點。生物法是指利用生物體催化降解有機污染物，轉化為其他污染物從而消除污染的一個受控或自發進行的過程［2］。生物法具有生產費用低，不產生二次污染，能在原位進行修復等優點，是一項具有發展前景的新技術［3］。本實驗以柴油為代表性油液污染物，從含油廢水中篩選出一株能以柴油為唯一碳源并生長良好的除油菌，并對其降解條件進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）菌種來源

從含油廢水中分離、篩選、馴化而得。

（2）培養基

液體營養培養基：葡萄糖10.0g／L，蛋白胨6.0g／L，酵母粉2.0g／L，pH 7.0。

固體營養培養基：葡萄糖10.0g／L，蛋白胨6.0g／L，酵母粉2.0g／L，瓊脂15.0g／L，pH 7.0。

石油培養基：柴油10g／L，硝酸胺2.0／L，磷酸二氫鉀2.0／L，微量元素液：4.0ml／L，pH 7.0。

微量元素液：硫酸鎂2.0g，硫酸銅0.5g，高硫酸錳0.5g，硫酸鐵0.5g，氯化鈣0.5g，水500mL。

1.2 方法

（1）除油菌的篩選及馴化

將10mL含油廢水加入到裝有90mL無菌水的三角瓶中，30℃，200r／min，振蕩30min。對振蕩均勻的樣品稀釋106，107，108倍，取0.1mL稀釋液到柴油培養基上，每個稀釋濃度重復3次，30℃，恒溫培養4～5d。把生長較好的菌落菌株在營養培養基平板上劃線并進行連續劃線培養，經過多次劃線純化后，直至分離純化得到單個菌株。純化后的菌種在柴油培養基平板上劃線馴化3～4次，獲得柴油降解菌種。將篩選到的柴油降解菌種進行試管斜面培養，并在4℃低溫保存。

（2）柴油標準曲線

取0.052g柴油于25mL容量瓶中，用石油醚定容至標線。取5mL該溶液于50mL容量瓶中，用石油醚定容至標線。分別取2，3，4，5，6，7，8，10 mL于比色管中，定容至10mL。采用紫外分光光度法［4］于264nm處測定其吸光度，繪制標線曲線，如圖1。其線性回歸方程為：Y＝0.3466X＋0.0008，R2＝0.9948。

圖1 柴油標準曲線

（4）影響除油菌降解率因素實驗方法

將除油菌接種于營養培養基中，培養48h，按5%的接種量接種于柴油培養基中，初始pH值為7.0，初始含油量為10g／L，恒溫30℃振蕩培養。分別進行以下幾組實驗，以確定除油菌降解柴油的最佳生長條件。a）將溫度分別設定為20，25，30，

（3）除油菌降解率的測定

將馴化后的除油菌接種至柴油培養基中，振蕩培養7天后，用紫外分光光度計測定其吸光度，計算出剩余含油量。降解率計算公式：35，40℃（pH值為初始值，培養基為見1.1節），培養7d后測定其降解率。b）將pH值分別設定為5.0，6.0，7.0，8.0，9.0（溫度為室溫，培養基為見1.1節），培養7d后測定其降解率。c）將柴油培養基分別配置成氯化銨濃度為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 g／L的溶液（溫度為室溫，pH值為初始值），培養7 d后測定其降解率。d）將培養菌的溫度、pH值、氯化銨的濃度都設定為前面3組實驗所取得的最佳條件，培養7d后測定其降解率。

2 結果與討論

2.1 除油菌的篩選

經過平板劃線分離培養，篩選馴化出對含油廢水具有降解效果的除油菌，其中一株菌種在高含柴油培養基中生長較好，選定為研究菌種。其在10g／L的柴油培養基中，培養3d后的降解率為37%。

2.2 除油菌降解率研究

（1）溫度對降解率的影響

溫度是微生物的重要生存因素［5］。微生物能生長的溫度范圍較廣，一般在－10℃～95℃都可以生長，但每一種微生物都有其最佳的生長溫度［6］。當溫度較低時，首先微生物生長緩慢，其次微生物的分解活動需要酶的參與，溫度低時，影響酶的活性；當溫度較高時，微生物過度生長并使微生物的酶發生變性，從而影響降解率。在微生物生長的最佳溫度范圍內，微生物的新陳代謝旺盛，對含油廢水的處理也較好。同時，溫度也影響石油烴類的物理性質和化學組成［7］。從圖2可以看出，除油菌的降解率是隨著溫度的升高而升高的，當溫度升高到30℃的時候，降解率是最高的，此后降解率隨著溫度的升高而降低，所以該除油菌的最佳生長溫度為30℃。

圖2 溫度對降解率的影響

（2）pH值對降解率的影響

微生物的生命活動、物質代謝與pH值密切相關。微生物的細胞膜電荷會隨著pH值的變化而變化，這就影響了微生物對營養物質的吸收利用和其在代謝過程中酶的活性。這是因為隨著pH值的變化，酶分子上的酸性及堿性氨基酸側鏈基團處于不同的解離狀態。具有催化活性的基團在總酶量中的比例不同使得酶分子的催化能力也不一樣［8］。從圖3可以看出，該除油菌在pH值為7.0時，降解率達到了最大值，說明該菌適合在接近中性的環境中生長。

圖3 pH值對降解率的影響

（3）氮源濃度對降解率的影響

氮源是作為合成細胞物質和代謝產物中含氮物質的原料，一般不用做能源物質。氮素不足常常會限制生物體的生長繁殖，因此應在培養基中加入適當和適量的氮源以滿足生物體的需要［9］。從圖4可以看出氮源濃度為1.5g／L時，降解率最大。這是因為氮源不足對菌體生長繁殖及降解功能影響較大。但氮源過量對菌株有一定的抑制作用［10］。

圖4 氮源濃度對降解率的影響

（4）優化條件下的降解率

通過前述實驗，得到該除油菌的優化條件為溫度30℃，pH7.0，氯化銨濃度1.5g／L。在此條件下振蕩培養7d，除油菌的降解率為56%。

3 結 論

（1）通過對含油廢水中的微生物進行篩選馴化可以得到以柴油廢水為唯一碳源的除油菌，本實驗通過篩選馴化的除油菌可以在以柴油為唯一碳源的柴油培養基中生長，對高濃度的含柴油廢水有一定降解能力。

（2）從含油廢水中篩選出一株除油菌，經馴化后，對柴油具有一定的降解率，在柴油濃度為10g／L的培養基中，降解率為56%。

（3）從實驗中得出，該除油菌的最優條件為：溫度30℃，pH7.0，氯化銨濃度1.5g／L。

［1］ 王漢道，鄧 皓，許春田.含油污水生物處理技術與展望［J］.油氣田環境保護，2001，11（4）：6－7.

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［3］ Atlas RM.Marine Pollution Bulletin［J］.1995，31（4）：178－182.

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［5］ 周群應，高延耀.環境工程微生物學（第二版）［M］.北京.高等教育出版社，2000.

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［7］ 韓寒冰，劉杰鳳.機油降解菌的分離及其降解特性研究［J］.安徽農業科學，2009，37（21）：9883－9884，9911.

［8］ 武金裝，劉紅玉，曾光明，等.柴油降解菌的篩選及其降解特性研究［J］.農業環境科學學報2008，27（5）：1742－1746.

［9］ 秦華明.高效油脂降解菌的篩選及其對油脂廢水的強化處理研究［D］：［華南理工大學博士學位論文］.廣東：華南理工大學食品與生物工程學院生物工程系，2003，44－45.

［10］ 何愛翠.微生物降解法處理工業含油廢水的研究［D］：［中南大學碩士學位論文］.湖南：中南大學應用化學，2007，36.