人胰腺癌裸鼠異種移植瘤模型的生物發光成像和超聲成像比較

李小穎，董 偉，張連峰

（中國醫學科學院，北京協和醫學院，醫學實驗動物研究所，衛生部人類疾病比較醫學重點實驗室，國家中醫藥管理局人類疾病動物模型三級實驗室，北京 100021）

胰腺癌是源發于胰腺的惡性腫瘤，文獻報道已建立胰 腺 癌 細 胞系有 SW1990［1］、Capan-2［1］、Patu8988［2］等約20余株［3］，其發病率和死亡率比大概是1：0.99。手術切除是胰腺癌能夠達到根治的唯一選擇，但胰腺癌早期缺少特異性癥狀，發現比較晚。同時胰腺癌對放療、化療不敏感，因此建立適宜的人胰腺癌動物模型，可以為深入研究胰腺癌的發生發展、侵襲轉移機制以及尋找新的治療策略提供有效的手段。

在臨床腫瘤學中，影像學方法測量腫瘤大小的改變是監測患者對抗腫瘤治療反應的常規方法，包括 CT（computed tomography，CT）、磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）、正電子發射 X線斷層攝影術（positron em ission tomography，PET）和超聲（ultrasound，US）。目前這些技術已經應用于小鼠腫瘤模型的監測［4-7］。除此之外還有生物發光成像技術。每種技術都有不同的優缺點，但彼此可以互補［8］。本實驗利用螢火蟲熒光素酶基因標記人胰腺癌細胞Capan-2并建立表達熒光素酶的胰腺癌裸鼠模型，利用生物發光成像和超聲成像技術對此模型內的腫瘤生長進行非侵入性的連續監測。同時評價了生物發光成像和小動物超聲探測系統在胰腺癌裸鼠模型分析中的應用和優缺點。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器：人胰腺癌細胞Capan-2本實驗室凍存，L-谷氨酰胺（GIBCO公司）、雙抗（GIBCO公司）、DMEM（GIBCO公司）、胎牛血清（GIBCO公司）、G418（AMRESCO 公 司）、脂 質 體 2000 （Invitrogene公司）。活體熒光影像系統（I.C.E.，日本 Roper公司）、倒置顯微鏡（Nikon TS100）。Vevo770TM小動物超聲探測系統（加拿大Visualsonics公司）

1.1.2 實驗動物：BALB/cA-nu裸小鼠購自北京維通利華實驗動物技術有限公司［SCXK（京）2007-0001］，6周齡，體重18～20 g，在本實驗室無特定病原體（specific-pathogen free，SPF）的飼養間［SYXK （京）2009-0003］飼養。所有實驗操作程序均經過實驗動物研究所實驗動物使用管理委員會批準（批準號為GC-09-2001）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養：用含10％胎牛血清、100 IU/m L青霉素，100μg/m L鏈霉素的 DMEM培養基作為Capan-2細胞的培養液，于5％CO2，37℃細胞培養箱內常規培養。

1.2.2 構建帶有篩選標記的載體：pCAGGS-Neo-Luc由本實驗室構建［8］

1.2.3 細胞轉染和篩選：采用脂質體 2000轉染Capan-2細胞（具體轉染步驟參照脂質體2000操作說明）。轉染后24 h，用含1000μg/m L G418的培養液篩選細胞，直至形成肉眼可見的單克隆，挑取單克隆于96孔板培養至匯合度達70％ ～90％后，傳代（1∶2傳代），取其中一塊96孔板加入用DMEM配置的底物luciferin（1 mg/m L）20μL，放入活體熒光影像系統攝像15 min，Slide Book 4.0軟件進行分析。

1.2.4 裸鼠胰腺癌移植模型的建立和活體熒光觀察：收集處于生長對數期的轉染細胞，稀釋至1× 107cells/m L。取0.1 m L細胞懸液接種于裸鼠右后肢皮下；同時三溴乙醇腹腔內麻醉裸鼠，75％酒精消毒皮膚，左上腹直腸旁線處行1.5 cmd的縱行切口，仔細分開胃和脾之間的薄膜，暴露胰腺，取0.1 m L細胞懸液接種于裸鼠胰腺被膜，并可見被膜下鼓起一透亮小泡為標志，各接種3只。分別在接種的7 d、14 d、21 d和28 d4個時間點觀察腫瘤的生長情況。觀察前每只裸鼠腹腔注射熒光素底物（1.5 mg/10 g），飽和三溴乙醇（0.18 m L/10 g）麻醉后放入活體熒光影像系統攝像，Slide Book 4.0軟件進行分析。

1.2.5 超聲圖像采集：實驗小鼠用三溴乙醇注射麻醉后（0.18 m L/10 g體重），置于檢測臺上，將臺溫設定為40℃，小鼠四肢用醫用膠布固定于涂有導電膠的電極上，記錄生理指標。用 VisualSonics? Vevo770?操作系統和專門用于小鼠的 RMV704高頻超聲探頭，進行 B型檢測。通過 VisualSonics? Vevo770?高分辨率小動物超聲系統的軟件進行數據分析。

2 結果

2.1 穩定高表達Luc的單克隆細胞株

經過轉染，篩選獲得穩定表達熒光素酶基因的細胞克隆（封2圖1），經過多次傳代表達水平穩定，標記細胞的形態、生長方式、生長速度等與未轉染細胞無明顯差異，選取高表達Luc的克隆株擴大培養并接種裸鼠。

2.2 裸鼠胰腺癌腫瘤模型的生物發光成像和小動物超聲影像學觀察

在胰腺原位裸鼠接種胰腺癌腫瘤細胞后第7天，用生物發光成像系統可以觀察到腫瘤發光（封2圖2，A-D），隨著觀察天數的增加，發光強度增強。超聲影像系統在腫瘤細胞原位接種的第7天不能測量腫瘤的大小，細胞接種第14天能測量腫瘤的大小，隨著接種時間的增加，腫瘤的面積逐漸增大（封2圖2，E-H）。

2.3 胰腺癌裸鼠皮下和原位移植瘤模型的小動物超聲影像學觀察

小動物超聲成像系統在腫瘤細胞皮下接種第7天，可以測量腫瘤的大小（圖3，A），但在腫瘤細胞原位接種的第7天不能測量腫瘤的大小（圖3，E）。腫瘤細胞皮下和原位接種第14天后，隨著接種時間的增加，腫瘤的面積逐漸增大（圖3，I）。腫瘤細胞在皮下生長的速度比原位生長速度快3倍左右。

3 討論

圖3 人胰腺癌皮下和原位移植瘤的小動物超聲成像比較A-D為原位移植瘤的小動物超聲成像；E-H為皮下移植瘤的小動物超聲成像，綠圈所指為腫瘤的面積；I為皮下和原位移植瘤生長曲線的比較Fig.3 Comparison of subcutaneous and orthotopically implanted cancer cells by ultrasound imaging A-D was the ultrasound imaging of orthotopic xenografts.E-H was the ultrasound imaging of subcutaneous xenografts.Green circles point to the tumor size.Iwas the comparison of tumor grow th between subcutaneous and orthotopic xenografts

高分清晰小動物活體影像實時顯微成像系統是小動物成像的專用設備，空間分辨率可達到30～ 100μm，已被廣泛應用于各種小動物的成像研究。如觀測小鼠胚胎在子宮內的生長狀態、引導顯微穿刺或吸引操作、神經發育監測、心血管功能量化檢測、微血管血液流量評估、腫瘤生長進行量化追蹤等。也可用于活體探測與癌相關的生物標記早期分子的表達［9-11］。

作為分子影像學的方法之一，生物發光成像技術因其操作簡單、所得結果直觀、靈敏度高的特點，越來越廣泛地被應用于生命科學、醫學研究及藥物開發等方面。本實驗利用螢火蟲熒光素酶基因標記人胰腺癌細胞 Capan-2，獲得穩定表達熒光素酶基因的細胞克隆，將其接種于裸鼠胰腺被膜及右后肢皮下，利用生物發光成像和超聲成像技術對此模型內的腫瘤生長進行非侵入性的連續監測。我們發現腫瘤細胞裸鼠胰腺原位移植成功率為75％，裸鼠皮下移植成功率為100％。人胰腺癌腫瘤細胞在裸鼠皮下生長的速度比原位生長速度快3倍左右。

生物發光成像和小動物超聲成像系統能夠進行無創、實時、動態的動物活體觀察，從而對同一實驗對象進行不同時間點的觀察，減少實驗動物個體間差異，與傳統的實驗方法相比，可以大大減少動物的用量，符合替代、減少、優化的“3R”原則。生物發光成像與小動物超聲成像系統相比具有（1）靈敏度高：生物發光成像系統在腫瘤細胞原位接種第7天，可以觀察到腫瘤發光；小動物超聲成像系統腫瘤細胞原位接種的第7天不能測量腫瘤的大小。（2）直觀簡便：試驗中只需將動物置于圖像采集箱中，即可見腫瘤的生長部位，大小。（3）視野大：可對小動物整體成像。但是由于腫瘤細胞通常沒有特定的光學性質來區分正常組織，多采取可檢測的特異性標記物來標記腫瘤細胞，使腫瘤細胞成為發光源，然后接種活體實現腫瘤細胞的活體成像，實驗周期較長；腫瘤的大小以靶細胞單位時間內發射的光子數的絕對值表示，不能直接測量腫瘤的大小［12］。小動物超聲影像與生物發光成像相比具有（1）實驗周期短：小動物超聲成像是利用不同介質對超聲波的回波強度不同成像的，因此不需要用特異性標記物來標記腫瘤細胞，實驗周期較小動物活體成像短。（2）實時生成圖像，檢查操作者可動態選擇對診斷最有用的部分觀察記錄，也可邊操作邊記錄。但超聲的檢查視野較生物發光成像小，探查深度有限，且不能為骨骼或者存在氣體的結構成像，成像質量有賴于操作者的經驗。

人胰腺癌皮下移植瘤模型，雖能維持來源腫瘤的組織結構和生化特性，但由于皮下移植瘤易形成纖維性假胞膜，腫瘤呈局限性、膨脹式生長，很少發生遠處臟器的轉移［13］，不符合人胰腺癌的生物學特性。人胰腺癌原位移植瘤模型不僅維持了原有瘤組織的結構，還更好地模擬人胰腺癌在體內的血供和生長環境，它在宿主體內能以類似于患者體內的方式顯示其惡性行為包括了原發腫瘤的生長、局部的浸潤和隨后遠處臟器的轉移整個過程［13］。

綜上，生物發光成像和超聲成像系統能夠無創、實時、動態的監測在體腫瘤的生長情況，生物發光成像與超聲成像相比，具有早期敏感和直觀簡便的優點，為腫瘤模型的研究提供了理想工具。

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