西藏小型豬Leptin及其受體胞外區片段的克隆及原核表達

吳麗紅，范 沛，王叢莉，劉玉鵬，黃黎珍，施振旦，顧為望

（1.南方醫科大學實驗動物中心暨比較醫學研究所，廣州 510515；2.華南農業大學動物科學學院，廣州 510642）

1994年Zhang等［1］在肥胖小鼠（ob/ob）中發現了肥胖基因，其編碼的蛋白質產物為瘦素（leptin）。體內瘦素水平的高低影響脂肪的沉積。但后來有人在先天肥胖動物（如db/db小鼠和fa/fa大鼠）和過量攝食導致的肥胖動物中血 leptin的水平升高，說明這些動物體內對leptin的反應減弱或無反應，此現象稱為 leptin抵抗［2］。Brown等［3］發現瘦素受體（leptin receptor，OBR）基因第12外顯子一個鳥苷酸殘基缺失，導致編碼序列框架移碼，小鼠出現糖尿病和肥胖。1995年，Tartaglia等［4］第一個成功地從小鼠脈絡叢中克隆出瘦素受體基因。

瘦素進入血液循環后游離或與瘦素受體結合，通過多種組織及多種形式的瘦素受體，作用于中樞及外周的多個位點，影響機體的許多生理和代謝過程，參與糖、脂肪及能量代謝的調節，促使機體減少攝食，增加能量釋放，抑制脂肪細胞的合成，進而使體重減輕，從而維持體內脂肪或能量平衡［5-7］。

本實驗主要通過體外克隆西藏小型豬瘦素成熟肽和瘦素受體編碼的部分基因，在大腸桿菌中定向表達重組豬瘦素成熟肽和瘦素受體蛋白片段，為進一步研究瘦素及其受體蛋白的生物學功能和利用瘦素及其受體重組融合蛋白預防與控制肥胖奠定研究基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

皮下脂肪、肝臟組織取自南方醫科大學實驗動物中心暨比較醫學研究所提供的西藏小型豬（1頭、1周歲、雄性、25 kg、實驗動物合格證號：粵監證字2006A055號），液氮運輸，-80℃低溫冰箱凍存備用。DH5α大腸桿菌、BL21（DE3）大腸桿菌和pRSETA載體均在華南農業大學動物科學學院遺傳與育種實驗室保存。

1.2 試劑和酶類

用于RNA抽提的Trizol，pMD18-T載體試劑盒，限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ，Taq DNA聚合酶，DNA分子量標準（DL2000），T4連接酶均為 TaKaRa產品；膠回收試劑盒、質粒小量提取試劑盒為Omega產品；反轉錄試劑盒為日本東洋紡（Toyobo）產品；用于純化的、帶有 His-tag的 50％ Ni-NTA 凝膠（Qiagen）和生物素化分子量標準（CST）購自基因公司（廣州）；OBR基因引物由上海生工生物工程技術有限公司合成；其它試劑均為進口或國產分析純。

1.3 RNA抽提與反轉錄

RNA抽提按照Trizol試劑盒說明書操作，反轉錄根據日本東洋紡反轉錄試劑盒說明書操作。

1.4 套式PCR引物的設計

根據公布的西藏小型豬瘦素基因序列（GenBank號：GQ240885.1）和豬瘦素受體基因胞外域序列（GenBank號：AF167719.1）設計引物序列如下：

1.5 OBR基因片段擴增（套式PCR法）

瘦素成熟肽PCR反應擴增體系為：上下游引物（20μmol/L）各 1μL、反轉錄產物 1μL、2× GC buffer I 2.5μL、dNTP（2 mmol/L）2.5μL、LA Taq（5 U/μL）0.25μL、雙蒸 H2O 16.75μL。反應條件： 98℃ 3 m in；98℃ 30 s，61℃ 30 s，72℃ 30 s；30個循環；72℃5 m in；10℃保存。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化，-20℃保存備用。以F1、R1為引物擴增得到的PCR產物命名為 OB。再以 OB為模板進行PCR擴增，反應體系為：引物（M1+N1）（20μmol/ L）1μL、OB 1.5μL、2×GC buffer I 2.5μL、dNTP（2 mmol/L）2.5μL、LA Taq（5U/μL）0.25μL、ddH2O 17.25μL。反應條件：98℃ 3 m in；98℃ 30 s，69℃30 s，72℃ 30 s；30個循環；72℃ 5 min；10℃保存。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后 -20℃保存備用。擴增得到的PCR產物命名為mOB。

瘦素受體片段PCR反應擴增體系為：上下游引物（20μmol/L）各1μL、反轉錄產物1μL、10×Ex Taq緩沖液 2.5μL、dNTP（2 mmol/L）2.5μL、Ex Taq（5U/μL）0.25μL、ddH2O 16.75μL。反應條件：94℃ 3 m in；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min；30個循環；72℃5 min；10℃保存。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化，-20℃保存備用。以F2、R2為引物擴增得到的PCR產物命名為AQ。再以AQ為模板進行PCR擴增，反應體系為：引物（M2+N2）（20 μmol/L）1μL、AQ1.5μL、10×Ex Taq緩沖液2.5 μL、dNTP（2 mmol/L）2.5μL、Ex Taq 0.25μL、ddH2O 17.25μL。反應條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s，57℃ 30 s，72℃ 45 s；30個循環；72℃ 5 m in；10℃保存。1％瓊脂糖凝膠電泳檢測純化后-20℃保存備用。擴增得到的PCR產物命名為mAQ。

1.6 OBR基因片段的T-A克隆和序列分析

將 PCR純化得到片段 mOB、mAQ分別與pMD18-T vector連接，轉化大腸桿菌 DH5α，挑取單菌落 7℃振蕩培養 12 h，提取質粒，經 PCR和BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定后，將含正確插入片段的重組質粒分別命名為TmOB、TmAQ，由上海英駿生物技術有限公司進行序列測定。

1.7 原核表達載體的構建

將經測序的陽性重組質粒 TmOB、TmAQ用BamHⅠ、HindⅢ進行雙酶切，切膠回收目的片段，同時將pRSETA質粒載體用BamHⅠ、HindⅢ進行雙酶切并切膠回收。然后將目的片段與質粒連接，轉化BL21大腸桿菌，小量提取質粒DNA進行PCR、酶切和測序鑒定，陽性重組質粒命名為pR-OB、pROBR-a。將鑒定正確的質粒細菌-20℃保種備用。

1.8 pR-OB、pR-OBR-a重組質粒的誘導表達和蛋白檢測、純化

將含有重組質粒pR-OB、pR-OBR-a的保種菌液劃板接種于含有終濃度為2.5％的氨芐青霉素鈉LB平板上，37℃培養箱靜置培養12 h。隨機挑取單菌落于2 m L離心管，37℃ 220 r/m in搖床培養過夜。次日吸取50μL菌液接種于含有1 m LLB培養基的4 m L離心管中，37℃ 220 r/m in搖床培養3 h后，加入IPTG使終濃度為1 mmol/L，于37℃220 r/ m in繼續培養5 h，離心收集菌液。菌體加入適量的buffer B（8 mol/L尿素溶液）和5×SDS-PAGE上樣緩沖液，100℃煮沸5 m in，快速離心取上清于12％ SDS-PAGE進行電泳分析。并用 Ni-NTA凝膠在變性條件下按說明書純化蛋白，最后用含有 8 mol/L尿素的洗脫液洗脫下pR-OB、pR-OBR-a重組融合蛋白。

2 結果

2.1 西藏小型豬組織總RNA提取

將提取的西藏小型豬組織總RNA進行瓊脂糖電泳檢測，電泳結果顯示28S、18S、5SRNA條帶清晰（見圖1），并且用核酸蛋白測定 RNA純度 A260/ A280=1.89（肝組織）、A260/A280=1.81（脂肪組織），說明提取的總RNA的完整性良好。

2.2 西藏小型豬瘦素成熟肽和瘦素受體編碼基因cDNA片段的擴增

圖1 組織總RNA瓊脂糖（1％）電泳圖Fig.1 Fig.1 Electrophoresismapping of tissuetotal RNA on 1％agarose gel.（A）L：liver tissue RNA；（B）F：adipose tissue RNA

采用套式PCR法擴增后，兩個片段分別取5μL PCR擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，在溴化乙錠染色后的凝膠上分別出現大小約為460 bp、660 bp左右的單一條帶，與預計結果相符。

2.3 西藏小型豬瘦素成熟肽和瘦素受體編碼基因片段的T-A克隆與測序

將套式PCR產物切膠回收純化mOB、mAQ分別與pMD18-T Vector連接，轉化大腸桿菌DH5α，挑取單菌落7℃振蕩培養12 h，提取質粒，經 PCR和BamHⅠ、HindⅢ雙酶切鑒定后，將含正確插入片段的重組質粒分別命名為TmOB、TmAQ，由海英駿生物技術有限公司進行序列測定。測序結果與GenBank上公布的序列對比（GenBank登錄號： GQ240885.1、AF167719.1）顯示，TmAQ與GenBank上公布的序列一致，TmOB與GenBank上公布的序列對比第 246位點堿基發生突變，但氨基酸序列一致。

2.4 重組原核表達載體的鑒定

將重組好的原核表達載體pR-OB、pR-OBR-a用限制性內切酶BamHⅠ、HindⅢ進行PCR和雙酶切鑒定。結果如圖2所示。圖2A在＞2 kb和460 kb處左右有明顯的條帶，圖2B在 ＞2 kb和660 kb處左右有明顯的條帶，說明重組質粒構建正確。

2.5 重組質粒 pR-OB、pR-OBR-a誘導表達與純化

圖2 重組原核表達載體PCR和雙酶切鑒定瓊脂糖（1.2％）電泳圖Fig.1 The electrophoresis results of PCRand enzyme digestion of recombined prokaryote expression vector by 1.2％agarose.

經SDS-PAGE分析，大腸桿菌 BL21（DE3）經IPTG誘導表達、純化，pR-OB在14.3～20.1×103之間約18×103處出現一條蛋白條帶（圖3B），占菌體總蛋白40％左右。pR-OBR-a在20.1～29.0× 103之間約27×103處出現一條蛋白條帶（圖3A），占菌體總蛋白值＜10％，分子量大小與預計的相符。而pRsetA空菌體均無相應的表達帶。說明重組質粒pR-OB、pR-OBR-a分別在大腸桿菌BL21（DE3）中可表達西藏小型豬瘦素成熟肽和瘦素受體片段蛋白。

圖3 重組質粒pR-OBR-a和pR-OB誘導表達與純化12％SDS-PAGE電泳圖Fig.3 The electrophoresis results of induced expression and purification of recombined pR-OBR-a and pR-OB by 12％SDS-PAGE.

3 討論

豬的物質代謝形式與人非常接近。西藏小型豬為新型的實驗動物，作為一種稀有的動物資源，其體形小，屬于瘦肉型的豬種，其在體脂調節機制上可能與其它豬種存在差異［8］。本研究對西藏小型豬瘦素成熟肽和瘦素受體胞外區部分基因片段進行克隆和測序，為日后進行西藏小型豬與不同豬種間、不同物種間瘦素基因及瘦素受體基因的對比分析奠定工作基礎。

已有研究表明，動物免疫瘦素重組融合蛋白后，抗體阻斷瘦素與瘦素受體結合，Leptin的作用得不到發揮，采食量下降，脂肪生長沉積，引起動物肥胖及與肥胖相關醫學并發癥出現。利用受體蛋白片段免疫，產生的抗體可以結合到受體胞外區［9，10］，根據不同的片段、不同的動物，抗體可能阻斷瘦素或抑制瘦素功能的發揮。如果抗體阻斷瘦素的作用，那么可以在促進脂肪沉積的作用，導致動物肥胖綜合癥的發生。如果受體上某個區域肽片段產生的抗體能夠模擬瘦素抑制脂肪生長沉積的作用，這將更好地改善動物肉質及控制肥胖，同時也可能通過影響營養水平而對生殖性能產生影響［11，12］。

國內廣西大學蘭干球等對巴馬小型豬leptin克隆，利用pRSETA載體進行原核表達載體的構建且酶切位點選擇EcoRⅠ和HindⅢ，在大腸桿菌BL21中表達［13］；中國農業大學胡曉湘等［14］對豬 leptin受體基因進行表達檢測與部分片段克隆分析，但豬瘦素受體重組融合蛋白的研究幾乎空白。本實驗對西藏小型豬 leptin的克隆和原核表達，與巴馬小型豬leptin原核表達相比，酶切位點選用的是BamHⅠ和HindⅢ，并在下游酶切位點增加終止密碼的一個堿基A。這使得所表達出來的重組融合蛋白大小更接近自然蛋白；對西藏小型豬瘦素受體胞外區片段的克隆和原核表達，制備重組融合蛋白，為研究瘦素及其受體的生理功能和應用提供實驗基礎。

本實驗在基因片段克隆時，采用了套式PCR的方法以獲得目的片段。套式PCR的優點在于其特異性較高，如果第一次擴增產生了錯誤片斷，則第二次能在錯誤片段上進行引物配對并擴增的概率極低。因此，本實驗采用套式PCR法，提高PCR擴增獲得的目的基因片段的準確性。另外，瘦素基因編碼區序列中GC值較高，本實驗使用了LA酶搭配GC Buffer進行 PCR擴增，以保證擴增的效率和準確性。

重組質粒pR-OB誘導表達與純化結果顯示，所表達的蛋白量占菌體總蛋白的40％左右，表達量相對較高，純化的結果也比較理想。這為日后制備融合蛋白作為抗原免疫動物，提供足夠的高純度瘦素奠定了基礎。

重組質粒 pR-OBR-a誘導表達與純化結果顯示，所表達的蛋白量少，不到菌體總蛋白的10％。表達菌的活性、誘導條件、目的蛋白毒性、蛋白的空間構型等可影響重組質粒表達效率。若日后需要大部分蛋白時，還需要優化表達的系統。

瘦素及其受體可用于調控人和動物的脂肪沉積。在畜牧業上主要用于動物生產性能的調控；在醫學上主要用于肥胖綜合癥的研究。本文通過對西藏小型豬瘦素成熟肽及瘦素受體胞外域克隆和原核表達，為探討用主動免疫方法建立西藏小型豬人類肥胖癥、糖尿病、心血管系統疾病等疾病動物模型，研究疾病發病機制、預防與控制肥胖提供方法和材料。

4 結論

本研究主要通過提取西藏小型豬肝組織、脂肪組織總RNA，進行RT-套式PCR擴增，獲得了瘦素成熟肽及瘦素受體基因編碼區的基因片段，并進行T-A克隆、測序分析。在核酸水平上為進一步研究瘦素及瘦素受體基因表達提供了條件；成功構建原核表達載體pR-OB、pR-OBR-a，并成功誘導表達純化西藏小型豬瘦素受體pR-OB、pR-OBR-a蛋白。

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