瘦素和轉化生長因子β1在大鼠肝纖維化過程中的作用

宋維芳，徐軍全，馬麗英，連小娟，王明亮，郭明清

（1.山西醫科大學汾陽學院病理生理學教研室，汾陽 032200；2.山西省汾陽醫院感染科肝病區，汾陽 032200）

肝纖維化是一種損傷愈合反應，是慢性肝病發 展成為肝硬化的必經過程，是多種因素參與的、復雜的、并且在一定程度上可逆的病理過程。瘦素是由ob基因編碼的蛋白類激素，對機體能量代謝的調節具有重要的作用。近年來的研究發現瘦素與肥胖、氧化應激和脂質代謝異常有關［1］。最新的研究顯示活化的星狀細胞瘦素mRNA表達和蛋白質合成均增加［2］，提示瘦素可能與肝纖維化有關，而轉化生長因子β1（transform ing grow thβ1，TGF-β1）是目前已知的最強的促纖維化因子之一，其在肝纖維化過程中主要的作用是促進細胞外基質的合成并抑制其降解，也有間接促星狀細胞增殖活化作用［3］。為了進一步明確肝組織瘦素和 TGF-β1在肝纖維化發生、發展過程中的作用，我們設計了本研究。

1 材料和方法

1.1 動物及材料

健康清潔級雌性 W istar大鼠，體重（220±20） g，購自山西醫科大學實驗動物中心［SCXK（晉） 2010-0001］。四氯化碳為中國中邦化工分析純；瘦素放射免疫測定試劑盒購于美國 Linco公司；TGF-β1ELISA試劑盒購于晶美生物工程有限公司；天狼猩紅和羥脯氨酸標準品購于美國Sigma公司。

1.2 動物的分組及處理措施

44只雌性W istar大鼠，常規在控光鼠房中分籠普食普水飼養，溫度18℃ ～25℃，濕度45％，1周后，確定所用實驗大鼠健康后，開始實驗。將44只大鼠隨機分為5組，正常對照組、模型組1周、模型組2周、模型組4周、模型組6周。正常對照組給予皮下注射生理鹽水，每周2次（周一和周五注射），其余各組給予首劑5 m L/kg體重CCl4分析純，之后按3 m L/kg體重皮下注射40％CCl4植物油（V/V）混合液，時間和次數與正常對照組同步，各組動物按實驗設計分別于給藥后1周、2周、4周和6周末模型形成后（正常對照組每次至少相應處理3只大鼠），在乙醚麻醉，無菌無熱源條件下，從大鼠腹主動脈采血，注入加有肝素（15 U/m L）的無熱源玻璃試管中，4℃離心20 m in（3000 r/m in），吸出血漿置于玻璃試管中封口，于-80℃低溫保存。取肝左葉一部分立即固定于4％多聚甲醛，24 h內石蠟包埋，5 μm切片；一部分于-80℃低溫保存。

1.3 檢測項目與方法

1.3.1 肝纖維化程度的判定 常規HE染色和天狼猩紅膠原染色、顯微鏡觀察并攝像和李文才等［4］報道的方法測定肝組織羥脯氨酸（Hyp）含量以判定肝纖維化的程度。膠原纖維呈紅色，運用 Image-pro plus5.0圖象分析軟件半定量計數肝組織膠原面積，每組織隨機取5個視野，通過比較各組肝組織的纖維化指數（FI）值評價肝纖維化程度［5］。FI=纖維染色區面積/整個視野面積×100％。

1.3.2 賴氏法測定血漿丙氨酸氨基轉移酶（ALT）。1.3.3 放射免疫法測定肝組織和血漿瘦素水平。

1.3.4 雙抗夾心酶聯免疫吸附實驗（ELISA）法測定肝織組織和血漿TGF-β1含量。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 一般情況及造模效果

實驗過程，正常對照組大鼠健康狀態良好，體重增加（100±30）g，肝臟表面光滑，色質紅潤；模型組大鼠實驗前期出現煩燥、易激惹，約1周后趨于平靜，隨著給CCl4時間延長活動慢慢減少，精神萎靡，毛發雜亂無光，食量減少，體重明顯下降，肝臟表面欠光滑，色質灰暗，體積變大，邊緣圓鈍。模型組病理切片觀察有較多纖維形成（彩插3圖1B、D）；從2周起模型組肝組織Hyp含量開始顯著升高，后呈遞增趨勢，6周時達最高（表1），提示肝纖維化模型形成。

表1 各組大鼠血漿ALT、肝組織Hyp和FI的變化Tab.1 Changes of plasma ALT，liver Hyp，FI in each group

表2 血漿和肝組織瘦素、TGF-β1的變化Tab.2 Changes of leptin and TGF-β1 in plasma and liver homogenate

2.2 肝組織病理學變化

HE和膠原染色顯示：光鏡下正常對照組大鼠肝細胞核多為單個，以中央靜脈為中心呈放射狀排列，小葉結構正常，肝細胞索排列規則有序，未見變性壞死，肝竇與匯管區有少量膠原纖維（彩插3圖1A、C）；模型組從1周末就有肝細胞出現脂肪變性，2周可現肝細胞脂肪變性加重，有輕度的壞死及纖維結締組織增生，4周末表現為壞死區及匯管區纖維結締組織增生較明顯并成細小條索，6周末可見匯管區有大量炎癥細胞浸潤，纖維增生明顯加重，呈星芒狀向肝小葉內延伸，有假小葉形成（彩插3圖1B、D）。Image-prop lus 5.0圖像分析結果：FI變化顯示模型組6周時肝組織中膠原纖維含量比正常對照組明顯增多（P＜0.05）（如表1）。

2.3 血漿ALT和肝組織Hyp含量變化

從第1周末起模型組ALT和Hyp含量比正常對照組有顯著升高，模型組ALT第2周末達高峰，第4至6周又逐漸回降（與2周組比較（P＜0.05），但與正常對照組相比仍顯著升高（P＜0.05）（表1）；Hyp則呈逐漸升高的趨勢（表1）。

2.4 血漿和肝組織瘦素、TGF-β1的變化

模型組各時期血漿和肝組織瘦素均高于正常對照組，且隨著 CCl4作用時間的延長呈梯度上升（表2），與正常對照組比較，模型組血漿和肝組織TGF-β1含量從4周開始顯著升高，6周達最高（表2）。

2.5 相關性分析

肝纖維化過程中：肝組織瘦素含量與 TGF-β1含量呈顯著正相關關系（r=0.887，P＜0.01）；肝組織瘦素含量與FI呈顯著正相關關系（r=0.754，P＜0.01）；肝組織TGF-β1含量與FI呈顯著正相關關系（r=0.899，P＜0.01）。

3 討論

肝纖維化是大多數慢性肝病共有的病理過程，是繼慢性損傷后肝組織修復過程中的代償反應，是慢性肝病發展為肝硬化的必經病理過程，目前認為其發病機制是由于各種原因，使肝細胞外基質（ECM）的沉積和降解的動態平衡打破而造成肝臟基質成分改變和數量的增加，其在一定程度上是一個可逆的過程。研究發現各種慢性損害因素引起肝損傷的病理過程中，損害因素可直接或間接介導免疫病理損傷，從而導致肝星狀細胞、肝竇內皮細胞、枯否細胞以及纖維化附近的炎癥細胞等分泌大量的TGF-β1，同時TGF-β1又可活化星狀細胞，進一步促進ECM成分的合成，同時抑制ECM的分解，導致ECM的大量沉積，從而引發肝纖維化的形成［6-7］。也有報道 TGF-β1在肝纖維化過程中可活化肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC），還可促進膠原基因的表達，從而促進細胞外基質的合成與沉積，是肝纖維化過程中最重的始動因子之一，TGF-β1作用涉及面廣，具有雙向作用，即其正常表達時可抑制炎癥反應、抑制細胞增殖，異常表達時可誘導細胞增殖、纖維蛋白的形成，從而促進纖維化的發生和發展［8］。

瘦素是由ob基因編碼的蛋白類激素，由167個氨其酸殘基組成，分子量為16×103［9］，通常認為瘦素主要是由脂肪細胞表達，但近年來的研究發現胎盤、肝臟組織和胃組織內可產生瘦素，且瘦素的表達與肝纖維化有著密不可分的關系［10］，也有研究發現，肝硬化患者血清瘦素水平明顯高于慢性肝炎組，但令研究者困惑的是，該兩組患者瘦素水平卻均低于正常對照組，并發現女性患者的血清瘦素水平明顯高于男性，也有研究發現血清瘦素水平無論男女，均與身體脂肪百分比（BFP）及身體脂肪量（BFM）有顯著相關性，由此可見影響血清瘦素水平的因素更多是非肝臟來源的，故肝纖維化瘦素血清學研究存在很大的障礙和局限性。最近有研究者發現肝組織在纖維化病程中有大量瘦素表達，由此提示肝組織原位瘦素與肝纖維關系可能更為直接，故我們通過動態觀察肝纖維化過程中肝組織瘦素、TGF-β1和 Hyp含量變化的同時輔以血漿相應指標的對照研究，并對肝組織瘦素、TGF-β1和肝纖維化指數（FI）進行了相關性分析。

在我們的實驗中，首先HE和膠原染色顯示，模型組有較多纖維形成，證明造模成功；其次我們發現，在肝纖維化過程中血漿丙氨酸氨基轉移酶（ALT）從模型組1周開始顯著升高，第2周達最高，后又回降，提示化學因素CCl4在導致肝纖維化的同時，可損傷肝功能，且在首次受到打擊時，可對肝功能形成強烈的應激性損害，后隨著機體的調節，可逐漸適應慢性損害，從而顯示出肝功能回降的趨勢；實驗結果顯示在肝纖維化過程中肝組織Hyp含呈遞增趨勢，表明在肝損害過程中肝臟的纖維化修復一旦激活，將會持續進行，直至發生肝損傷的不可逆病變-肝硬化病理過程；最后我們在研究的過程中，為了排除其它因互對瘦素和 TGF-β1的影響，直接對模型組各時期肝組織瘦素表達和 TGF-β1水平以及 FI進行了相關性分析，發現瘦素表達和TGF-β1水平以及 FI兩兩成顯著正相關，另不論血漿還是肝組織，瘦素均先于TGF-β1表達升高，由此我們初步推斷，肝組織原位瘦素水平的是肝纖維化發生發展過程的一個重要始動環節，并且肝組織原位瘦素水平的升高可能是通過上調 TGF-β1表達，從而促進肝纖維化的發生和發展。

然而，瘦素在肝纖維化發生、發展過程中的作用有多大，是肝纖維化發生、發展的關鍵因素，還是一種輔助因素，目前仍然不清，我們今后的實驗將進一步研究；還有肝組織原位瘦素在人類慢性肝損傷過程中的作用機制如何，也是我們今后研究的目標。

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［10］盧建華，劉勇鋼，郎振為，等.慢性乙型肝炎患者肝組織瘦素的表達［J］.中華傳染病雜志，2007，25：177-178.