局部化療對宮頸鱗癌組織中Bcl-2、Bax表達水平及細胞凋亡的影響

陳茜 蔡東閣

宮頸癌是全球范圍內最常見的婦科惡性腫瘤之一，在我國婦女中發病率居高不下,并趨向年輕化，故對其治療方法提出了新的挑戰。放療不再是首選治療方法，隨之出現的新輔助化療越來越受到重視，尤其對于希望保留卵巢功能的年輕患者具有重要意義。宮頸是一個可暴露器官，容易直接治療和觀察，局部化療操作方便，不需麻醉，副作用輕，具有一定的優越性。本研究通過檢測局部化療前后宮頸癌組織中凋亡相關基因Bcl-2、Bax的表達及細胞凋亡的變化，初步探討局部化療的作用機制，為制定個體化治療方案和提高療效提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 選取2007年～2009年在我院住院治療的宮頸鱗狀細胞癌患者40例，年齡平均45.17歲，所有患者按國際婦產科聯盟FIGO分期標準進行分期：Ⅱa期23例，Ⅱb期17例，病理分級鱗狀細胞癌Ⅱ級28例，Ⅲ級12例；均行廣泛性子宮切除加盆腔淋巴結清掃術；在手術前未曾接受放療及全身化療等其他輔助治療。其中治療組選取在手術前接受宮頸局部化療患者20例，對照組選取手術前未接受過任何輔助治療患者20例。

1.2 方法

1.2.1 宮頸癌病灶局部注射化療 將順鉑30～50mg加生理鹽水10m L稀釋，囑患者排空大小便后取膀胱截石位，用20m L注射器套長7號針頭,將溶解后的適量順鉑在宮頸病灶周邊多點注射入腫瘤基底部。根據腫瘤大小決定注射針距,一般外生型穿刺深度為1～5cm，每點推注2～3m L；潰瘍型穿刺深度為0.3～1.0cm，每點推注1～2m L。依腫瘤退縮情況決定注射次數，一般2～3次，最多5次，順鉑累計總量60～160mg。每3天一次，停藥一周后手術。

1.2.2 Bcl-2、Bax表達的檢測 采用免疫組織化學S-P法。取同一患者手術切除的宮頸癌病灶組織及卵巢組織各一塊，置于10％甲醛溶液中固定,石蠟包埋，4～5μm厚連續切片。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，抗原熱修復。3％H2O2室溫20m in，10％正常山羊血清封閉，室溫孵育20m in，棄血清，滴加稀釋后的一抗（兩個抗體的稀釋度及來源），4℃過夜。37℃復溫1h，PBS沖洗。PBS沖洗，DAB顯色15m in。自來水充分沖洗，蘇木精復染，梯度乙醇脫水，透明，中性樹膠封片。

表1 對照組與治療組Bcl-2、Bax的表達及bcl-2/bax比值Tab 1 Expressions of Bcl-2, Bax and the the ratio of Bcl-2 and Bax w ith and w ithout local chemotherapy

1.2.3 細胞凋亡的檢測 采用流式細胞儀檢測細胞凋亡率[1]。取患者手術切除新鮮宮頸癌癌灶及卵巢組織標本，剪碎，加入胰酶2m L靜置5m in，加PBS液4m L，吹打。放入120目尼龍網過濾，濾液1000r/m in離心7～8m in。去上清，再加PBS液吹打，再次離心。加入PI（碘化丙啶）150μm L，4℃避光染色20m in后上機操作。

1.3 結果判定

1.3.1 免疫組織化學檢測結果判定 每標本切片均隨機選取5個高倍視野（400倍），每視野計數200個細胞，瘤細胞內出現棕黃色顆粒判斷為陽性。根據陽性細胞所占百分比分級：陽性細胞數＜5％為陰性（-）；5％～50％為陽性（+）；＞50％為強陽性（++），在判斷上兼顧陽性染色的強度及數量[2]。

1.3.2 流式細胞儀檢測指標 未經宮頸局部化療患者以及局部化療患者手術切除新鮮標本中局部病灶、卵巢組織中DNA周期及細胞凋亡指數。

1.4 統計學分析 采用SPSS10.0軟件包進行統計學處理，計數資料采用統計學x2檢驗及直線相關性分析。

2 結果

2.1 Bcl-2和Bax在宮頸癌組織以及卵巢組織中的表達 免疫組化結果顯示，Bcl-2和Bax的陽性顆粒均分布在細胞漿內，為胞漿型，呈局灶性分布，少部分呈彌漫分布。宮頸癌組織Bcl-2表達呈下降趨勢，Bax表達呈上升趨勢，治療組bcl-2/bax比值明顯低于對照組。治療組卵巢組織Bcl-2表達呈下降趨勢，Bax表達呈上升趨勢，治療組Bcl-2/Bax比值低于對照組（表1）。

2.2 局部化療對宮頸癌細胞凋亡的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，凋亡細胞在流式細胞儀的DNA直方圖上呈特征的亞二倍體峰。宮頸癌組織細胞凋亡率治療組為（45.36±2.37）％，對照組為（12.93±4.96）％，治療組高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。卵巢組織細胞凋亡率治療組為（35.64±5.43）％，對照組為（10.05±1.29）％，治療組高于對照組，差異亦有統計學意義（P＜0.05）。

2.3 細胞凋亡率與bcl-2,bax表達的相關性分析 宮頸癌癌灶中，細胞凋亡率與bcl-2表達呈反相關（r=-0.9633,P＜0.05），即隨著bcl-2表達的下降細胞凋亡率上升；細胞凋亡率與bax表達呈正相關（r=0.9694,P＜0.05），即隨著bax表達的上升細胞凋亡率上升；細胞凋亡率與b cl-2/bax比值呈負相關（r=0.9529，P＜0.05），即隨著bcl-2/bax比值的下降細胞凋亡率上升。卵巢組織中細胞凋亡率與bcl-2/bax表達的相關性同癌灶。

3 討論

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，在我國宮頸癌發病率居高不下，并趨向年輕化，故對其治療方法提出了新的挑戰。常規的放療或全身化療對早期宮頸癌有較好的效果，但對中晚期及高危宮頸癌患者的療效仍不滿意。宮頸癌局部化療利用子宮與外界相通這一自然腔隙，把順鉑直接注射到宮頸腫瘤組織內，以達到局部濃度大而全身副作用少的優點。對于癌灶較大有手術困難的患者，可在術前瘤體局部注射化療藥物以縮小腫瘤體積，提高手術療效。局部化療還可以增強腫瘤組織對放射線的敏感性，對于中晚期宮頸癌患者在放療前輔以局部化療，可大大提高放療的療效[3]。

以往認為，腫瘤的發生是原癌基因的激活及抑癌基因的失活導致細胞增生過度和分化異常所致，現證實腫瘤的發生亦是細胞凋亡異常的結果[4]。在宮頸癌中不僅有細胞的過度增殖，同時還存在細胞的凋亡異常,兩者是宮頸癌發生的生物學基礎[5]。細胞增殖與死亡之間的動態平衡對生物體的正常發育至關重要,腫瘤的發生正是這種動態平衡被打破、細胞數量惡性膨脹的結果。bcl-2是目前研究最多的與細胞凋亡關系密切的基因之一，bax基因是近年來新發現的一種凋亡促進基因，屬bcl-2同一家族，其不但拮抗bcl-2的抑制凋亡作用，而且有直接促進細胞凋亡的功能[6]。bcl-2/bax的比值[7]，對于決定細胞接受刺激信號后存活與否有關鍵作用。Oltvai[8]研究證明在宮頸癌組織中bcl-2占優勢可使bax同型二聚體減少，bcl-2/bax異型二聚體增多，腫瘤細胞對凋亡的敏感性降低，使之易于逃避凋亡原的刺激，致使瘤細胞存活期延長，導致腫瘤不斷增大，說明在宮頸癌發生發展中，細胞凋亡是腫瘤抵抗惡性轉化的關鍵防御機制[9]。易慕華等[10]發現bcl-2的表達為全漿型或核周型為主，而這一部位也正好是bax失表達部位，提示細胞凋亡的激活可能與bcl-2/bax的表達失衡有重要關系。

本實驗結果顯示經過局部化療的宮頸癌癌灶及卵巢組織中細胞凋亡明顯高于未經過局部化療組，bcl-2表達降低而bax表達上升，bcl-2/bax比值有下降趨勢且與細胞凋亡率有相關性。提示宮頸癌的發生發展與細胞凋亡密切相關，局部化療可能誘導了腫瘤細胞的凋亡，同時對于卵巢組織也有一定程度的影響，從而可降低宮旁轉移率[11]。bcl-2/bax平衡的改變參與了凋亡調控，bcl-2、bax的表達情況以及bcl-2/bax比值變化可作為局部化療敏感性和治療效果的評價指標。

宮頸癌局部化療近期療效肯定，操作方便，雖有一定的技術要求，但無明顯痛苦，不需麻醉，不需靜脈水化。與其他途徑化療相比所需時間短，無穿刺疼痛和靜脈炎發生，全身毒副作用輕，使病人生存質量得到了有效的提高,在中晚期及高危宮頸癌病人的治療中具有巨大的潛在價值。

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