海洋軟骨魚軟骨抗腫瘤物質的研究進展

馮 剛 ，王 斌 ，羅紅宇，曲有樂

（1.浙江海洋學院食品與藥學學院，浙江舟山 316004；2.佳木斯大學藥學院，黑龍江佳木斯 154007）

惡性腫瘤嚴重威脅著人類的健康和生命，每年死于癌癥的病人約占總死亡人數的四分之一，且發病率呈逐年增長態勢，癌癥的防治成為醫學和生命科學工作者主要研究的課題之一。目前用于癌癥治療的抗腫瘤藥物有幾十種，但對多數常見實體瘤仍缺乏有效藥物，且不少抗腫瘤藥在臨床應用過程中產生了不同程度的耐藥性。因此，篩選高效低毒的抗腫瘤藥物成為抗腫瘤新藥研發最為重要的任務。

軟骨魚類即軟骨魚綱，是僅存最古老的有頜脊椎動物，主要包括鯊魚、魟魚、鰩和銀鮫等，是海洋生態系統主要的組成部分之一[1]。上世紀80年代，LEE和LANFER[2]首次發表了鯊魚軟骨含有抗腫瘤血管增生成分的研究論文，后來陸續從鯊魚軟骨中分離得到了多種抗腫瘤活性成分[3]。目前研究表明，軟骨魚軟骨的抗腫瘤活性成分主要包括以下三類：（1）多糖：新生血管生成抑制因子、腫瘤細胞抑制因子和免疫調節因子；（2）低分子量蛋白：新生血管生成抑制因子和免疫調節因子；（3）蛋白多糖：新生血管生成抑制因子。本文對軟骨魚類抗腫瘤活性成分的研究進行綜述，為其后續開發提供可借鑒的依據。

1 海洋軟骨魚軟骨多糖

1.1 軟骨多糖新生血管生成抑制因子

1971年，FOLKMAN[4]提出腫瘤生長依賴于血管的學說，后來根據腫瘤血管的生長和分布狀況將腫瘤的生長分為血管前期和血管期。在血管前期腫瘤細胞處于休眠狀態，腫瘤生長得到明顯抑制；而在血管期，腫瘤的新生血管生長活躍，依靠豐富毛細血管網提供活躍代謝環境，腫瘤得以快速生長和轉移。如能抑制新生血管生長，則可以抑制腫瘤的生長和轉移。因此，以腫瘤血管為靶點的研究是目前腫瘤治療研究領域的熱點。

軟骨是一種無血管組織，因對腫瘤侵噬具有一定的抵抗性而能夠抑制新生血管的生長[5]。軟骨多糖屬于糖胺聚糖，是生物體內分布廣泛的重要生理活性物質。朱丹等研究表明魟魚軟骨多糖對雞胚絨毛尿囊膜血管形成具有顯著的抑制作用，其可能通過抑制腫瘤血管形成，發揮良好的抗腫瘤活性。姜華茂等[6]發現赤魟Dasyatis akajei軟骨多糖膀胱灌注可抑制大鼠原位膀胱腫瘤生長，其機制可能與抑制腫瘤血管生長有關。周莉莉等[7]研究結果顯示，鯊魚軟骨多糖可以有效的抑制人臍靜脈血管內皮細胞株（HUEVC）的生長，其抑制率達到（45.615±0.084）%，并能有效的抑制雞胚絨毛尿囊膜的新生血管形成，（PBS對照組血管數目為18.750根，鯊魚軟骨多糖試驗組血管數目為7.750±1.545根，差異有統計學意義，P<0.05）；結果提示鯊魚軟骨多糖在抑制內皮細胞生長與新生血管生成方面發揮著重要作用。郭斌等[8]的實驗結果表明，赤魟軟骨多糖體外能顯著抑制血管形成，作用機制可能在于下調VEGF、b-FGF、MMP-9基因和蛋白表達，體內抗腫瘤機制可能是阻斷小鼠Lewis肺癌移植瘤模型細胞的細胞周期。

以上研究發現，軟骨魚軟骨多糖對腫瘤血管的形成具有顯著的抑制作用，可以抑制腫瘤細胞的生長。

1.2 軟骨多糖腫瘤細胞抑制因子

近年來，國內外研究證實軟骨魚軟骨多糖除了含有血管生成抑制因子，同時含有腫瘤細胞抑制因子。腫瘤細胞抑制因子能夠以誘導細胞凋亡的形式清除癌細胞，從而直接抑制腫瘤細胞的生長。

郭斌等[8]從黃點魟Dasyatis gerrardi軟骨中提取的粘多糖成分對人T淋巴細胞白血病（CEM）細胞的群體增殖有明顯的抑制作用，對小鼠足墊部移植瘤生長抑制作用顯著。郭斌和朱丹等研究發現赤魟軟骨素對荷瘤小鼠腫瘤的生長和CEM細胞株群體的增殖具有較強的抑制作用，且能夠誘導增強CEM細胞表面標志CD2，HLA-I分子的表達。病理學可見，應用低劑量組赤魟軟骨多糖的小鼠S-180腫瘤細胞異型性不明顯。由此推斷，魟魚軟骨多糖具有一定的誘導腫瘤細胞分化的作用。

馮艷紅等[9]將赤魟軟骨多糖（RCG）應用于膀胱癌EJ細胞研究，發現其誘導細胞凋亡具有時間和劑量依賴性，可將細胞周期阻滯于G2/M期，導致細胞凋亡。

1.3 軟骨多糖免疫調節因子

軟骨多糖類化合物的抗腫瘤作用，主要在于它能提高宿主的免疫功能，增加免疫細胞的活性。鯊魚軟骨中含有豐富的胺基糖、粘多糖和溶菌酶。胺基糖和粘多糖可以激活免疫系統，活化T、B細胞和巨噬細胞攻擊癌細胞的能力，提高機體免疫能力，彌補化療、放療后因機體的免疫力低下而造成的抵抗力不足。

朱丹等研究表明赤魟軟骨多糖能顯著提高荷瘤小鼠胸腺指數和脾指數（P<0.01）；能激活并增強荷瘤小鼠腹腔巨噬細胞吞噬功能；增強荷瘤小鼠脾細胞IL-2及腹腔巨噬細胞IL-1和TNF產生能力（P<0.05），赤魟軟骨多糖對荷瘤小鼠具有明顯的免疫增強作用。欒潔等關于鯊魚軟骨粘多糖可以激活免疫系統的研究也表明了上述觀點。

綜上，軟骨魚多糖抗腫瘤活性物質主要包括新生血管生成抑制因子、腫瘤抑制因子和免疫因子。其中，國內外對新生血管生成抑制因子研究地比較深入，它主要是抑制腫瘤細胞一些酶的活性或一些血管刺激因子而阻止血管內皮細胞的增殖和遷移，從而起到抑制腫瘤細胞的作用。軟骨多糖直接來源于動物組織，無明顯的毒副作用，體內外實驗又顯示其具有良好的抗癌活性，有可能成為很有前途的抗癌新藥，但其抗癌效果及作用機制則需要進行更加深入的探討。

2 海洋軟骨魚軟骨低分子量蛋白

2.1 軟骨蛋白新生血管生成抑制因子

近年來，隨著抗血管增生療法研究的深入，抑制新生血管生成的研究可能成為未來腫瘤治療的突破口，因此吸引了國內外許多科學家從事該領域的工作。Folkman實驗室報道了兩種重組蛋白“endostatin”和“angiostatin”，具有非常明顯抑制血管生成及腫瘤生長的作用，在國際上引起了轟動[10]。

OIKAWA等[11]從日本鯊魚軟骨中提取得到血管生成抑制因子的相對分子質量在1 000～10 000之間。能夠抑制哺乳動物膠原酶、蛋白激酶和胰蛋白酶等的活性，抑制毛細血管上皮細胞的增生和遷移，從而有效地阻止已著床的腫瘤細胞建立新生血管網。尚俊英等[12]從廣西北海鯊魚軟骨中得到的小于100kDa低分子蛋白，結果顯示該低分子蛋白對血管內皮細胞的生長抑制率為（36.77±2.98）%，黏附抑制率為（52.95±4.48）%，遷移運動抑制率為（68.05±4.04）%，可顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜的新生血管的形成。

我國臺灣學者SHEU等[13]從藍鯊Prionace glauca軟骨中分離純化得到了2條相對分子質量為10 kDa和14 kDa的新血管生成抑制因子U-995，可顯著抑制人臍靜脈內皮細胞的增殖與遷移，并會引起新血管的中斷和破裂，阻止破壞由腫瘤壞死因子TNF-α誘導的雞胚絨毛尿囊膜血管生成，防止由膠原酶誘導的膠原溶解。

2000-2001 年，沈先榮等[14]從我國沿海鯨鯊Rhincodon typus軟骨中提取分離了2種高度純化的血管生成抑制因子SCAIF1和SCAIF80，它們的相對分子量分別為18 kDa和8 kDa，并證實為2種新的活性蛋白質。兩因子不僅能顯著抑制血管內皮細胞的分裂增殖和運動遷移，還能顯著抑制雞胚絨毛尿囊膜的血管生成，顯著抑制小鼠體內腫瘤的生長，且沒有顯示任何毒性，具有較好的新藥開發前景。

陳建鶴等[15]采用鹽酸胍抽提法從中國姥鯊Cetorhinus maximus軟骨組織得到相對分子質量為8.3 kDa的蛋白質，對體外血管內皮細胞增殖和體內新生血管生長具有較強的抑制活性，并能顯著抑制小鼠移植S180肉瘤的生長。2003年曾鋒等[16]從廣東陽江鯊魚軟骨中純化獲得分子量為17 400的鯊魚軟骨血管生成抑制因子（SCAI-c），對雞胚絨毛尿囊膜血管的形成具有顯著抑制效應。

羅紅宇等[17]從赤魟軟骨中獲得高純度的血管生成抑制因子（DCAIF-I）對雞胚絨毛尿囊膜新生血管生成具有明顯的抑制效果，并具有一定的量效關系。SDS-PAGE-考馬斯亮藍染色顯示為一條帶,分子量為62 kDa。

鄭蘭紅應用鹽酸胍抽提、丙酮分級沉淀、超濾、凝膠層析等分離技術，從青鯊Prionace glauca軟骨中分離純化并鑒定了一種新的血管生成抑制因子。經SDS-PAGE和N-末端氨基酸序列分析顯示，分子量為15.5 kDa，采用蛋白數據庫分析表明這是一種新發現的鯊魚軟骨蛋白。研究發現無毒或低毒的PG155是一個具有顯著的抗新生血管生成蛋白，提示其可能開發成為一個新型的抗腫瘤藥物。

上述研究表明軟骨魚軟骨蛋白的血管生成抑制因子主要是通過抑制膠原酶、蛋白酶和胰蛋白酶等的活性，阻止血管內皮細胞的增殖和遷移，從而有效阻止已著床的瘤細胞建立新生血管網絡，達到阻斷腫瘤細胞的氧氣和營養物質來源的目的，使之保持在無血管靜止狀態。此外抗血管增生活性物質一般不會引起耐藥性[18]。ROBERT等[19]認為血管生成抑制劑是無抗性的抗腫瘤藥，因為其作用于腫瘤的重要靶區為遺傳性相當穩定的血管內皮細胞。同時近年來許多學者和研究人員把目光轉移至鯊魚軟骨血管抑制因子，包括anti-MMPs[20]、anti-VEGF[21]、細胞凋亡因子[22]和TPA等[23]，它們通過拮抗內皮細胞生長因子、下調內皮細胞生長因子受體、內皮細胞表面黏附分子和促進內皮細胞凋亡等綜合作用抑制新生血管的形成。

由于不同的研究者采用不同的分離提取方法，使蛋白降解程度不同，進而得到了分子質量各異的具有血管生成抑制活性的降解物。如Luer[24]發現鯊軟骨的蛋白質提取物中有6～7種蛋白質能抑制腫瘤血管生長，而Folkman認為鯊魚軟骨中有13種活性蛋白質能抑制腫瘤血管生長。因此學術界對此項研究尚未有固定的標準。

2.2 海洋軟骨低分子量蛋白免疫調節因子

我國古代就有中藥典籍記載鯊魚軟骨有提高人體免疫力的作用。王勁等[25]根據祖國醫學對鯊魚藥用功效的記載，結合現代對鯊魚軟骨的認識，探討了鯊魚軟骨抗癌增效及調節免疫功能的作用。結果表明，鯊魚軟骨可明顯提高荷瘤小鼠的NK細胞活性并增強其M動細胞的吞噬能力，其與化療藥物（CTX、SFU、ADM）合用可提高抗腫瘤作用，證實鯊魚軟骨具有較好的扶正（提高免疫功能）作用和明顯的抗癌增效作用。

1964年，SAVA等[26]應用溶菌酶治療10例晚期癌癥患者取得了一定的治療效果。后續研究發現，溶菌酶的抗腫瘤活性是通過增強機體的免疫功能這一途徑實現的，其在體內可以象單核因子和淋巴因子那樣，調節淋巴細胞和巨噬細胞介導的細胞毒作用[27]。陳建鶴[28]等從中國姥鯊軟骨組織獲得介導溶菌酶活性的高純度蛋白質（Sp15，分子量15.2 kDa），并首次完成了N-末端22個氨基酸殘基序列的測定；該研究也首次表明，鯊魚軟骨組織的抗腫瘤作用不僅僅是由新生血管抑制因子所介導，軟骨源溶菌酶樣分子（Sp15）至少亦參與介導了部分的抗腫瘤活性。同時Sp15具有極強的抑制體外血管內皮細胞增殖活性。以往的溶菌酶抗腫瘤研究都局限于雞蛋清源溶菌酶，該研究為抗腫瘤研究開辟了新的道路。

HASSAN等[29]從角鯊Heterodontus Francisci中分離純化得到了分子量為14 kDa和15 kDa兩種蛋白質的一個低分子量組分，該組分具有大多數免疫激活效應，能夠增強免疫系統反應，活化NK細胞及巨噬細胞以增強攻擊癌細胞的能力，并能抑制新生血管生成。海洋軟骨魚軟骨蛋白的免疫調節因子主要是一類小分子蛋白。據報道，溶菌酶分子可作為一種較強的免疫調節因子而用于預防和治療惡性腫瘤。與此同時，國內對海洋軟骨魚軟骨蛋白的免疫調節作用研究并不多，需要進行更加詳細深入的研究。

3 海洋軟骨抗腫瘤蛋白多糖類

科學家認為，由于不同的研究者采用不同的分離提取方法，使蛋白多糖大分子的降解程度不同，進而得到了分子質量各異的具有血管生成抑制活性的降解物[30]。

王路等[31]從姥鯊軟骨中提取分離到了一種堿性的親水性糖蛋白（含糖量8%），對膠原酶、內皮細胞DNA合成和血管生成均有明顯抑制作用，但對腫瘤細胞無直接的殺傷和抑制作用。由于其抑制膠原酶的活性屬競爭性抑制，因此推測其結構可能與膠原酶相似。2000年美國加州大學的LIANG和WONG[32]從長尾鯊Thresher Sharks軟骨中分離純化得到血管生成抑制因子SCF2，SCF2是一種含有硫酸角質素和多肽的熱穩定性蛋白多糖，對培養的內皮細胞具有特異的血管生成抑制活性。上述研究表明雖然海洋軟骨魚軟骨蛋白多糖的降解程度不同，但均能有效的抑制血管生成從而抑制腫瘤生長。

4 展望

軟骨魚軟骨的抗腫瘤機制是多樣的，除了新生血管生成抑制因子、腫瘤細胞抑制因子和免疫調節因子外，還有抗入侵因子、調節前列腺素和血栓素的水平以及抗氧化作用。其中對新生血管生成抑制因子、腫瘤細胞抑制因子和免疫調節因子的研究比較深入，而對抗入侵因子、調節前列腺素和血栓素的水平以及抗氧化作用的研究還需要進一步的探索。軟骨魚軟骨的毒副作用小且抗癌作用明顯，成為未來抗癌領域的有效藥物指日可待。

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