Aβ結合乙醇脫氫酶與阿爾茨海默病

王明宇，楊 宇，吳 江

近年來，線粒體功能障礙(Mitochondrial dysfunction)對包括阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)在內的中樞神經系統退行性疾病的影響日益引起科研人員的關注。Aβ結合乙醇脫氫酶(Aβ binding alcohol dehydrogenase，ABAD)是一種能與β-淀粉樣肽(β-amyloid peptide，Aβ)特異性結合的線粒體酶，諸多的研究結果顯示ABAD與AD的發生、發展有著密切關系，本文就其研究進展綜述如下。

1 線粒體損傷與AD

線粒體損傷對中樞神經系統的影響日益引起人們的重視。研究發現，在與年齡相關的神經系統退行性疾病，包括阿爾茨海默病、帕金森病(Parkinson’s disease，PD)、肌萎縮側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、Friedrich 共濟失調(Friedrich ataxia，FRDA)，都能夠發現線粒體功能障礙的證據［1］。線粒體被稱為真核細胞的“動力工廠”(power houses)，其基質和內膜處含有三羧酸循環的酶類和多種呼吸鏈復合體，是細胞能量代謝的主要結構。Rhein等［2］培養了三聯(含APPsw、PS2和tau)轉基因AD鼠并進行蛋白質組學分析，結果發現，與對照組比較，有24種蛋白水平顯著下調，其中1/3為線粒體相關蛋白。研究發現，線粒體損傷是AD的早期指標，其相關指標的改變早于病理學改變［3］。然而，這些改變是AD的原因還是結果，尚需進一步研究論證。AD時線粒體的主要改變有:(1)三羧酸循環相關酶，如丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)、α 酮戊二酸脫氫酶(αketoglutarate dehydrogenase，KGDH)等活性顯著下降［4，5］;(2)呼吸鏈復合體活性降低，ATP合成減少［6］;(3)電壓依賴型陰離子通道(voltage-dependent anion channel，VDAC)受損;(4)線粒體源性過氧化氫和超氧化物產生增加等。

在臨床或動物研究中，這些變化可以通過應用正電子發射斷層攝影技術(positron emission tomography，PET)得以反映［7～9］，通過對局部腦組織生化代謝的觀察，可以有效地評價認知功能下降的程度。

2 β-淀粉樣肽與AD

β-淀粉樣肽是APP的代謝產物之一，由39～43個氨基酸殘基組成，是構成老年斑核心和血管壁沉積物的主要成分。研究發現，加入micromolar水平的Aβ就能夠通過多種機制直接損傷神經元的結構和功能［10，11］。以往認為，Aβ存在于神經元之外，通過由可溶狀態到不溶狀態的轉變，引發一系列細胞損傷過程，最終導致AD的發生。近些年來，隨著研究的不斷深入，越來越多的證據證實了Aβ在神經細胞內的存在［12，13］。進一步發現，細胞內Aβ與線粒體損傷和氧化應激反應密切相關。1997年，應用酵母雙雜交技術，Yan等［14］發現了一種位于線粒體基質內并可以與Aβ特異性結合的乙醇脫氫酶，并最終將其命名為Aβ結合乙醇脫氫酶(Aβ binding alcohol dehydrogenase，ABAD)。ABAD 是由 261個氨基酸組成的線粒體酶，由Xp11.2染色體HADH2基因編碼。ABAD的轉錄產物在正常人組織中幾乎無所不在，其中在肝臟和心臟中表達最多，在腦組織則主要在神經元中表達。

3 ABAD與AD

3.1 ABAD 生理功能

生理狀態下，ABAD通過與NAD或泛醌還原系統結合參與細胞內的電子鏈傳遞和氧化還原過程。研究證實，ABAD在維持細胞內環境穩定和對抗應激中發揮保護作用。體外研究發現，作為短鏈脫氫酶超家族成員，ABAD能夠可逆性地催化一系列NAD/NADH依賴的氧化還原反應，其底物非常廣泛，包括線性乙醇、類固醇類(如17β-雌二醇)、S-乙酰乙酰輔酶A和β-羥丁酸等［15，16］。但生理條件下ABAD的催化作用在線粒體中并非處于主導地位。例如，ABAD和D-β-羥丁酸脫氫酶(D-b-hydroxybutyrate dehydrogenase)都能夠催化線粒體D-β-羥丁酸，但是后者與D-β-羥丁酸反應的Vmax大約是ABAD的1000多倍。也就是說，當體內局部內環境穩定時，ABAD對β-羥丁酸的代謝作用微乎其微。然而，當機體內環境處于缺血或營養缺乏狀態，即當β-羥丁酸成為維持代謝穩態的主要底物時，ABAD表現出顯著的催化活力。研究人員用去除葡萄糖、以β-羥丁酸作為主要能量底物的培養液培養COS細胞，發現培養2～4d后出現細胞活力喪失和ATP水平迅速下降。而在同樣條件下，過表達ABAD的COS細胞則較好地保持了細胞活力和ATP濃度。隨后在培養基中加入［13C］D-β-羥丁酸并進行核磁共振分光檢測(Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy，NMR spectroscopy)研究，發現在過表達ABAD的COS細胞中，乙酰輔酶A在三羧酸循環中的水平明顯升高［16］。另有研究發現，ABAD可以具有與線粒體伴侶分子cyclophilin D結合的能力。cyclophilin D是一種肽基脯氨酰順反異構酶，當其轉移至線粒體內膜時可被激活，引起線粒體膜通透性轉換孔(membrane permeability transition pore，MPT)［17］開放，破壞線粒體功能。ABAD 與 cyclophilin D［18～20］結合后可以抑制其向線粒體內膜的轉移，從而起到保護細胞的作用。

另一方面，當編碼動物或人的ABAD基因發生缺陷時，可以發現ABAD對生物體的生存與發育具有極其重要的作用。當果蠅的ABAD同系物scully基因發生點突變時，可以發現其生殖能力嚴重下降，顯微研究顯示突變的精母細胞胞質中出現脂質包涵體，伴有線粒體數量顯著減少，體積變小并出現線粒體嵴腫脹［21］。Lenski等［22］報道了一個在 ABAD 192位殘基發生同義突變的家族，該突變使該家族四代成員ABAD表達水平降低，并出現伴X染色體遺傳的精神遲滯、手足徐動癥和行為異常等癥狀。

3.2 ABAD在AD中的作用

實驗數據表明，ABAD在AD中表達明顯增多。用特異性抗ABAD抗體對尸檢腦組織進行Wsetern blot分析時發現，AD患者ABAD蛋白的表達水平明顯高于對照組。形態學研究發現，發生AD時，ABAD在腦組織神經元，特別是Aβ聚集附近處表達升高。Lue等應用免疫印跡法發現，ABAD在AD腦顳葉和海馬中的表達比對照組分別高28%和40%。而不受AD影響的部位，如小腦，其ABAD表達與對照組沒有明顯差異。應用共聚焦顯微觀察和免疫金電鏡技術研究發現，Aβ和ABAD共同定位與受AD影響的腦組織的線粒體基質中［23］。為明確線粒體中Aβ-ABAD的相互作用給神經元帶來的影響，研究人員培養了過表達mAPP和人ABAD(Tg mAPP/ABAD)的轉基因小鼠［23，24］，實驗證實了 Aβ 和ABAD在Tg mAPP/ABAD小鼠線粒體中的相互結合。在對神經元中的研究中發現［25］，Aβ和ABAD顯著加重了Aβ誘導的氧化應激和神經毒性。在水迷宮實驗中，Tg mAPP/ABAD小鼠與Tg mAPP小鼠相比，前者表現出更為嚴重的學習和記憶損害。在出生后4.5～5個月時，當Tg mAPP小鼠、Tg ABAD小鼠和非轉基因小鼠學習和記憶能力尚表現正常時，Tg mAPP/ABAD小鼠已經表現出了嚴重的學習和記憶損傷。在Tg mAPP/ABAD小鼠8～10個月齡時，檢測其海馬CA1層區域性興奮性突觸后電位，可以發現其基礎突觸傳遞和長時程增強的損傷。以上結果均證實ABAD加重了Aβ誘導的毒性作用。

免疫印跡實驗發現，在AD腦組織勻漿和線粒體提取物中，Aβ和ABAD可以結合成一個38KD的復合體。而在對照組中，這種復合體含量極少［25］。體外結合研究表明，Aβ1-42、Aβ1-40和Aβ1-20都可以以劑量依賴的方式與ABAD結合，而Aβ25-35不能與ABAD結合，這說明ABAD與Aβ之間的結合并不是非特異性的。也提示Aβ可能是通過其N末端結合 ABAD，而保留其 C末端，使之能與更多的 Aβ結合［23］。利用高分辨率結晶攝影技術(High-resolution crystallography)對Aβ-ABAD復合體進行研究發現，在Aβ存在的條件下，NAD輔助因子失去了與ABAD結合的能力，這說明Aβ使ABAD結構發生了異常改變。Aβ與ABAD的結合誘導了ABAD天然結構中與其活性密切相關的 LD、LE、LF環和NAD結合部位發生大量的結構畸變。進一步發現，與NADABAD的結晶相比較，LD環的結構異常是Aβ-ABAD復合物所獨有的。到目前為止，ABAD是唯一可以與Aβ結合的NAD依賴的短鏈脫氫酶/還原酶(SDR)超家族成員。研究人員發現，與其他SDR成員相比，ABAD的LD環中包含一個特有的插入序列(殘基95-113)，這個獨特的插入序列被認為是Aβ的識別位點。為了進一步證實LD環對Aβ結合的特異性，研究人員通過包含該區域(92-120殘基)的人ABAD肽(ABAD-DP)，應用表面細胞質基因組共振技術來檢測它是否具有抑制Aβ與完整ABAD結合的能力。實驗結果表明，ABAD-DP能夠抑制Aβ40和Aβ42與完整 ABAD的相互結合，而含有相同氨基酸成分，但序列相反的肽ABAD(120-92)或ABAD反向肽(ABAD reversed peptide，ABAD-RP)則被證明不具有這種抑制能力。這些數據說明，ABAD的LD環對于ABAD同Aβ的結合是至關重要的［23］。

上述實驗表明，ABAD可以加劇 Aβ的毒性作用，而ABAD-DP可以通過特異性地結合Aβ，避免Aβ-ABAD復合體的形成，發揮神經保護作用。利用基因融合技術，研究人員在ABAD-DP的N末端融合HIV-1 TAT蛋白的膜轉導域，使其能夠穿過細胞膜，以利于在細胞內表達［26，27］。免疫細胞化學實驗發現該融合肽ABAD-DP可以進入到神經元線粒體中。進一步發現，ABAD-DP加入到Tg mAPP/ABAD小鼠的神經元培養基后，抑制了神經元的氧化應激損傷，特別是抑制了超氧陰離子和過氧化氫的產生，而ABAD-RP組沒有出現這種改變。不同的實驗證實，ABAD-DP可以顯著減少Aβ誘導的神經元毒性作用，減少線粒體細胞色素c釋放、ROS的產生和神經元的凋亡［23，24］。這說明，干擾ABAD-Aβ的相互作用，能夠保護Aβ介導的線粒體和神經元損傷。

綜上，不難看出Aβ結合乙醇脫氫酶是一把“雙刃劍”。在Aβ不存在時，ABAD對機體發揮多重保護作用。在應激條件下，這種保護作用尤為顯著。作為一種多功能酶，ABAD的保護作用涉及多種機制，如對多種底物的催化作用，對異亮氨酸和支鏈氨基酸的分解代謝，對糖代謝和呼吸鏈的維持等，實驗表明，ABAD的過度表達改善了缺血和帕金森病動物模型的病理損害。然而，當ABAD與過量的Aβ發生接觸時，這些對細胞的保護作用發生了戲劇性地逆轉。體外研究表明，在純化的ABAD中加入micromolar水平的Aβ40就能夠抑制它的催化活性。轉基因動物亦研究證實，Tg APP/ABAD雙轉基因鼠的認知下降程度和病理學損害都要明顯重于Tg APP單轉基因鼠。ABAD與Aβ的相互作用使ABAD結構發生畸變，失去了同NAD結合位點，ABAD活性被抑制，喪失了催化同多種底物的能力和對異亮氨酸與支鏈氨基酸的分解代謝作用。這種改變將導致:(1)產生大量有害的中間代謝產物，例如MHB等。這些中間代謝產物的積聚，干擾了三羧酸循環的正常過程，破壞了線粒體呼吸鏈的穩定，導致呼吸鏈復合體，特別是復合體 IV(cytochrome Oxidase，COX)活力下降，引起ATP產生不足;(2)ABAD與Aβ的相互作用可能取代了其與cyclophilin D的結合，導致后者轉位至線粒體內膜，引起線粒體膜通透性轉換孔(MPT)開放，破壞線粒體的正常結構和功能;(3)還有學者認為ABAD的失活影響了其對雌激素類物質的代謝，從而影響后者的神經保護作用。

最終，這些改變都會引起線粒體功能障礙，產生大量活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)，并激活一系列級聯反應，觸發細胞凋亡途徑，最終導神經元死亡。但是到目前為止，精確的機制還未能完全闡明，尚有待于進一步探索。

4 展望

對ABAD的深入研究，也為我們治療AD提供了新的思路。我們認識到，抑制Aβ和ABAD的相互作用，就能夠達到神經保護的作用。在這一點上，不同的實驗室進行了有益的嘗試［28，29］。將ABAD-DP作為藥物亦為一種有效可行的治療方式［30］。但目前存在的問題是，合成的短肽存在價格昂貴、半衰期短的缺點，以至于不能高效特異地與Aβ42結合而發揮其作用，從而限制了其臨床應用。我們課題組構建了融合ABAD-DP和人硫氧化還原蛋白1(human thioredoxin-1，hTRX)的慢病毒載體，實現了其在細胞內穩定表達，并證實了其對PC12細胞的神經保護作用［29］。應用基因技術，使治療肽以一種經濟、有效、穩定、安全的方式發揮治療作用，將為未來阿爾茨海默病等神經系統變性疾病的治療帶來希望。

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