熒光偏振免疫法測定血中依替米星的濃度

毛 璐，卞 婧，張 威，甄健存 （北京積水潭醫院藥劑科，北京 100035）

硫酸依替米星系半合成氨基糖苷類抗生素，是我國自行研制的I類新藥，其抗菌譜廣、抗菌活性強、抗交叉耐藥性好，且耳、腎毒性遠低于其他氨基糖苷類抗生素，可以用于耐慶大霉素菌株，即產氨基糖苷類鈍化酶菌株的感染[1]。既往依替米星的血藥濃度測定采用微生物法，操作較為繁瑣，檢測時間長，而且患者不能同時使用其他抗菌藥物[2]，使用受到一定的局限性。近期有報道采用高效液相色譜法進行測定，但是生物樣本前處理較為繁瑣，提取后還需要進行柱前衍生化，且回收率不高[3]，不能滿足日常臨床檢測的需要。熒光偏振免疫法（fluorescence polarization immunoassay, FPIA）用于血藥濃度分析，適用于多種藥物的血藥濃度測定，具有測定速度快、操作方便、無需預處理樣品、取樣量少、測定精度和靈敏度高、抗干擾能力強等特點。

1 儀器與試劑

熒光偏振免疫血藥濃度測定儀（TDx，美國Abbott公司），慶大霉素TDx檢測試劑盒（美國Abbott公司，批號77404Q100），依替米星標準品（中國藥品生物制品檢定所，批號130365-200301）。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

準確稱取硫酸依替米星標準品適量，置于10 mL量瓶中，用磷酸鹽緩沖液配制成1000 μg·mL-1的濃溶液。

2.2 血清與緩沖液配制依替米星溶液濃度測定的等效性實驗

取“2.1”中的濃溶液分別用空白血漿與磷酸鹽緩沖液配制成1 μg·mL-1的待測樣品，選用空白血清、磷酸鹽緩沖液為空白對照品。吸取待測品350 μL，平行測定5次，記錄檢測值，結果磷酸鹽緩沖液配制的依替米星測定值為（0.58±0.06），血漿濃度測定值為（0.56±0.07），經t檢驗，P＞0.05，兩種配制方法無顯著性差異。因此，可以使用磷酸鹽緩沖液代替血清，進行標準曲線及其他質控點的配制。

2.3 標準曲線的制備

取“2.1”中的濃溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋，配制成0.5，1.5，3.0，6.0，10，20 μg·mL-1的溶液。應用TDx進行測定，以依替米星濃度（X）為橫坐標，實際響應值（Y）為縱坐標。最低檢測限為0.2 μg·mL-1，得到標準曲線方程為：Y=0.439X+ 0.177 2，r=0.998 1，結果表明：在0.5～20 μg·mL-1濃度范圍內線性關系良好。

2.4 精密度和準確度考察

2.4.1 取“2.1”中的濃溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋，配制成1，8，16 μg·mL-1的溶液，應用TDx進行測定，于同日測定5次；之后將溶液于－24 ℃冷凍保存，每日融化后測定一次，連續測量5 d，計算日內和日間相對標準偏差。日內標準偏差分別為7.30%，2.54%，1.23%；日間相對標準偏差分別為9.73%，3.32%，1.79%。

2.4.2 取“2.1”中濃溶液用空白血清配制成1 μg·mL-1的溶液，于－24 ℃冷凍保存48 h，冷凍前及室溫融化后分別用TDx進行測定，冷凍前、后的結果分別為（0.85±0.11）和（0.95±0.10），n=3，應用t檢驗，P=0.30，兩組數據無顯著性差異。

2.4.3 取“2.1”中的濃溶液用磷酸鹽緩沖液稀釋，配制成1，8，16 μg·mL-1的溶液，應用TDx進行測定，將測定值代入回歸方程計算依替米星濃度，回收率=（測定平均值－空白值）/配制液的濃度×100%。結果：低、中、高三個濃度的回收率分別為（93.12±9.74）%，（102.41±2.73）%，（89.50±1.45）%。

3 討論

3.1 熒光偏振免疫測定法是利用熒光偏振及抗原、抗體競爭結合的免疫反應原理進行血藥濃度測定。熒光標記的藥物與患者體液中的藥物共同競爭抗體。依替米星與慶大霉素結構相似，與慶大霉素的抗原抗體反應有部分交叉，可與慶大霉素競爭同一抗體，本次研究嘗試用市售的慶大霉素試劑盒進行依替米星血藥濃度的檢測就是基于這一原理。本試驗結果也證實了這一推斷，但是測定值并非依替米星的實際濃度，需要公式進行轉化。

3.2 本方法利用依替米星與慶大霉素結構相似的原理進行檢測，因此，慶大霉素以及與慶大霉素結構相似的奈替米星和西索米星會干擾依替米星的測定。而其他結構的藥物如阿米卡星、氨芐西林、紅霉素、萬古霉素、頭孢類抗生素、喹諾酮類抗生素等對測定的影響均小于1%。臨床上對于難治感染，雖然會同時使用2種或2種以上抗生素，但將結構相似的兩個氨基糖苷類藥物合用的可能性很少，因此對于絕大多數患者使用該方法測定依替米星濃度是可行的。在測定前應該詢問患者用藥史，如之前使用了慶大霉素、奈替米星及西索米星應考慮到對實驗結果的干擾。

3.3 氨基糖苷類抗生素的血藥濃度與療效、毒性反應相關，有效血藥濃度窄，血藥濃度個體差異大，是非常需要進行血藥濃度測定的一類藥物，也是抗生素中被監測最多的藥物[4]，尤其是用于兒童[5]、老人、以及腎功能不全的患者時。依替米星血藥濃度測定中，既往使用的微生物法和高效液相色譜法很難滿足臨床上日常治療藥物監測的要求，而FPIA法不需要預處理樣品，可直接進樣檢測，樣品微量即可進行檢測，而且可以檢測多種體液，如血漿、血清、尿、唾液、脊髓液、傷處和腎組織提取液等。應用熒光偏振免疫法測定依替米星的血藥濃度，方法靈敏度高，操作簡便，檢測時間短，可以用于臨床快速檢測依替米星的血藥濃度。同時，也可以進一步了解該藥在體內的代謝和分布規律，幫助患者個體化用藥，發揮藥物的療效，避免或減少毒性反應，為臨床合理用藥提供重要依據。

[1] 王舒，高永良.氨基糖苷類藥物研究新進展[J].解放軍藥學學報，2009，25(4)∶329-332.

[2] 吳抗美，陳吾法.微生物法測定硫酸依替米星血藥濃度[J].中國醫院藥學雜志，2001，21(4)∶251-252.

[3] 郭巧珍，李培忠，關勇彪.高效液相色譜法測定大鼠血漿和腎臟中硫酸依替米星的含量[J].解放軍藥學學報，2010，26(3)∶247-248.

[4] 黃正明.關于治療藥物監測和藥物不良反應監測若干問題的探討[J].中國藥物應用與監測，2005， 2(1)∶39-42.

[5] 丁俊杰，張智耀.兒科治療藥物監測[J].中國藥物應用與監測，2005， 2(2)∶34-36.