評價納米顆粒細胞毒性的方法

李曉東,徐 紅

(吉林大學第一醫院胃腸內科,吉林長春130021)

自20世紀80年代末以來,納米科技迅猛發展,納米材料在醫學成像、疾病診斷、藥物傳輸、癌癥治療、基因治療等領域的應用越來越廣泛[1]。但是,人們對于納米材料對環境安全和人體健康所潛在的影響卻知之甚少[2]。為此,納米毒理學應運而生[3]。納米毒理學是專門研究納米顆粒或材料毒性的學科,運用一系列方法來分析納米材料在體內和體外所產生的影響[4]。一般利用體外細胞毒性實驗來進行納米材料的細胞毒性評價,它是一類在離體狀態下模擬生物體生長環境,檢測醫療器械和生物材料在接觸機體組織后所產生的生物學反應的體外實驗[5]。納米顆粒與細胞的相互作用研究剛剛開始[6]。細胞成活力評價包括增殖、壞死、凋亡等方面。本文就納米毒理學中常用的細胞毒性檢測方法作一簡要綜述,以供大家對納米材料的細胞毒性進行評價時作為參考。

1 增殖檢測

1.1 MTT法

MTT法即四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法。MTT比色分析法由Mosmann在1983年首創,其基本原理是活細胞內的線粒體脫氫酶能將染料MTT轉變為不溶于水的藍紫色結晶體甲瓚(formazan)顆粒,后者的生成量與活細胞數目和/或細胞活性呈正相關[7]。用二甲亞砜溶解所生成的甲瓚,然后通過酶標儀可以測定570 nm波長附近的吸光度。細胞增殖越多越快,則吸光度越高;細胞毒性越大,則吸光度越低。MTT法被廣泛用于評價多種納米材料的體外細胞毒性[8,9]。與其他毒性分析方法相比,MTT法有很多優點,例如:簡單、經濟、快速、靈敏,無放射性污染,不需預標記靶細胞[10]。缺點:需分別加入MTT及DMSO;測試后細胞不能繼續培養;生成的甲瓚不易充分溶解。

1.2 WST-1法

WST-1是由日本同仁化學研究所開發的第一個水溶性四唑鹽試劑,可以被線粒體內的一些脫氫酶還原生成高度水溶性的橙黃色甲瓚(formazan)顆粒,生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。WST-1是MTT的一種升級替代產品,和MTT或其它MTT類似產品如XTT等相比有明顯的優點。第一,WST-1產生的甲瓚顆粒是水溶性的,不需要特定的溶解液來溶解。第二,WST-1更加穩定。第三,WST-1線性范圍更寬,靈敏度更高。近年又出現了一種CCK-8試劑,其原理與WST-1法相同,也具有WST-1法的優點。侯春梅等[11]研究證明,CCK-8法顯色時間短、操作簡便、靈敏度高、重復性好,而且檢測后的細胞可重復利用,具有一定的實用性,可以替代MTT法并廣泛應用。

1.3 [3H]胸腺嘧啶摻入法

測定摻入新合成的DNA中的[3H]胸腺嘧啶的量,是一種敏感度非常高的檢測細胞增殖的方法。原理是將放射性同位素3H代替H,根據細胞核酸代謝率不同,3H摻入的量也就不同,再用閃爍儀器定量檢測不同樣品中摻入的3H量,來反應細胞的增殖狀態。如果[3H]胸腺嘧啶摻入量減少,說明細胞增殖受到抑制。但是這種方法經常不被采用,因為費用較高,而且需要接觸3H同位素,對體外的細胞有損傷[12,13]。

1.4 Alamar Blue法

新一代熒光染料Alamar Blue為活細胞代謝指示劑,易溶于水。該法的原理為氧化型Alamar Blue可被活細胞中的線粒體酶還原,還原后染料發生顏色和熒光改變,其深淺與活細胞數量成正比,可用分光光度計或熒光檢測儀檢測[14]。該方法已被用于檢測:多種化學物質的細胞毒性試驗;淋巴細胞、貼壁或不貼壁的人及動物細胞株、細菌及真菌的增殖;細胞凋亡的量化以及細胞介導的細胞毒性試驗等。楊陽等[15]研究發現 Alamar Blue法是一種簡便、敏感、安全、經濟的方法,可用于體外測定細胞增殖及化療或免疫制劑的細胞毒作用。

2 壞死檢測

細胞壞死是因病理而產生的被動死亡,往往會導致細胞膜破裂。在體外納米毒理學實驗中,細胞膜的完整性是一個可以用來評價細胞活力的指標[16,17]。常用的評價細胞膜完整性的方法包括:(1)檢測細胞對某些離體活體染料的吸收,例如,臺盼藍(Trypan Blue)[18],中性紅(Neutral Red)[19],碘化丙啶(propidium iodide)[20]等。(2)檢測細胞死亡后滲漏到細胞培養基中的活性酶的量,主要是乳酸脫氫酶LDH分析法[21]。

2.1 染色法

臺盼藍和碘化丙啶是帶電荷的分子,不能進入活的細胞。當細胞膜出現破裂時,臺盼藍就會進入細胞中,并且在605 nm波長處有較強的吸收。碘化丙啶進入細胞以后,會嵌入DNA和雙鏈RNA中,用617 nm波長激發會發出熒光。中性紅易溶于水和醇,水溶液呈紅色,醇溶液為黃色。在生理條件的pH值時,中性紅是不帶電荷的,此時,中性紅既能進入活細胞,也能進入死細胞。在活細胞中,溶酶體的酸度較高(pH≈4.8),中性紅會被質子化并聚集于溶酶體中,在540 nm波長處有較強的吸收。因此,中性紅可使活細胞染成紅色,而死細胞不變色,這點和臺盼藍相反。以上這些檢測技術可重復性好,并且應用流式細胞儀可提高檢測速度。

2.2 乳酸脫氫酶LDH法

乳酸脫氫酶(LDH)是一種糖酵解酶,定位于細胞胞漿內。一般情況下,LDH不能透過細胞膜,當細胞受損傷或死亡時可釋放到細胞外,此時培養液中LDH活性與細胞死亡數目成正比。乳酸脫氫酶能催化乳酸生成丙酮酸,丙酮酸與2,4-二硝基苯肼反應生成丙酮酸二硝基苯腙,在堿性溶液中呈棕紅色,可通過比色求出酶活力。通過檢測細胞培養液上清中的LDH的活性,可判斷細胞受損的程度。優點:測定迅速,避免了同位素的使用,并且能夠進行定量分析。缺點:(1)乳酸脫氫酶是大分子,只有靶細胞膜完全被破壞后才能釋放出來,不能較早的反映細胞的存活狀況。(2)影響因素較多,例如,培養基、測定環境的溫度、pH、反應時間等[22]。

3 凋亡檢測

細胞凋亡(apoptosis),又稱程序性細胞死亡,是指細胞在一定的生理或病理條件下,遵循自身的程序,自己結束生命的過程[23]。細胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細胞死亡形式。在2.2中介紹的方法只能檢測壞死的細胞或者處于凋亡晚期的細胞,只有結合凋亡檢測技術才能完整地揭示出細胞死亡的整個過程。凋亡檢測技術被廣泛地應用于納米毒理學研究中,包括:細胞形態學變化,膜聯蛋白V(annexin-V)法[24],DNA階梯法(DNA laddering)[25],彗星實驗(the Comet assay)[26],TUNEL法[27,28]等。

3.1 形態學觀察

普通光學顯微鏡下可觀察到貼壁生長的凋亡細胞皺縮、圓化,細胞的體積變小,但細胞膜完整,常可見胞膜發泡的現象,細胞凋亡晚期可見凋亡小體。在熒光顯微鏡下,吖啶橙染色后,活細胞核染色質呈現均勻分布的黃綠色熒光,胞質呈橘紅色熒光,而凋亡細胞核染色質的黃綠色熒光濃聚在核膜內側。透射電鏡下可觀察到細胞凋亡時特征性的超微結構改變,如凋亡細胞體積變小,細胞質濃縮,表面微絨毛消失,核染色質凝聚、邊緣化,呈新月形。

3.2 膜聯蛋白V法

膜聯蛋白Ⅴ(AnnexinⅤ)是一種相對分子質量為35-36 kD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白,能與磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)高親和力特異性結合。PS正常位于細胞膜的內側,但在細胞凋亡的早期,PS可從細胞膜的內側翻轉到細胞膜表面。因此,應用膜聯蛋白Ⅴ法可鑒定早期細胞凋亡。將膜聯蛋白Ⅴ用熒光素(FITC,PE,EGFP)標記,以標記了的膜聯蛋白Ⅴ作為熒光探針,利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生。

3.3 DNA階梯法

細胞凋亡或壞死時,核內DNA都會發生斷裂。區別在于,凋亡細胞DNA斷裂點有規律地發生在核小體之間,出現長度為180-200 bp的DNA片段,電泳時呈現階梯狀條帶;而壞死細胞的DNA斷裂點無規律性,產生的雜亂片段在電泳時呈現模糊的連續性條帶。利用這一特征可以將凋亡細胞與壞死細胞相區別。優點:簡便易行,費用低廉。缺點:易受機械損傷、化學物質刺激等其他因素影響,而且只能定性,不能定量。

3.4 彗星實驗

“彗星”電泳技術,即單細胞凝膠電泳(Single-cell gel electrophoresis,SCGE),可用于觀察單個細胞DNA的損傷。此法是將少量分散懸浮的單個細胞與1%低溫瓊脂糖液混合后在冰凍玻片上制成瓊脂板,細胞經過水解和堿化處理后,在較高pH值的環境下進行電泳。當DNA有斷裂損傷時,細胞核中帶有陰性電荷的DNA斷片就從核心向陽極方向移動,形成一個類似“彗星”的圖象,根據“彗星”的頭部和尾部的大小和比率,從而確定細胞DNA損傷的程度。馬愛國等[29]研究證明,“彗星”電泳技術是較敏感的DNA斷裂損傷分析技術,在檢測體內和體外細胞DNA的輕微損傷方面有著廣泛的應用前景。

3.5 TUNEL法

TUNEL法,即脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(terminaldeoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nickend-labeling,TUNEL),其原理是:細胞凋亡時,染色質DNA斷裂產生大量的粘性3′-OH端,在脫氧核糖核苷酸末端轉移酶的作用下,將脫氧核糖核苷酸與熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸酶或生物素形成的衍生物標記到 DNA的3′-OH端,可通過酶聯顯色或熒光檢測定量分析結果。該法將分子生物學與形態學相結合,能準確地反應細胞凋亡時典型的生物化學和形態學特征,可檢測出極少量的凋亡細胞,因而在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。

4 結語

納米技術是柄雙刃劍,納米材料可能給人們的健康帶來潛在危害。目前,納米材料的毒理學研究還很不完善,人們對納米材料毒性的認識也很貧乏。納米毒理學研究與納米技術發展是相互促進的,必須一起協調發展,才能更好地完成科學技術造福于人類的目的和任務[30]。對納米材料毒性的研究,會促使人們重新設計、制造毒性較少的納米顆粒,從而最終使納米科技成為安全造福人類的新技術。

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