MOG抗原誘導的自身免疫性腦脊髓炎模型的建立及組織蛋白酶抑制劑 cystatin F的表達

高文婷,范 凱,李 寧,馬堅妹

(1.大連醫(yī)科大學實驗動物中心,遼寧大連 116044;2.大連醫(yī)科大學解剖學教研室,遼寧 大連 116044)

MOG抗原誘導的自身免疫性腦脊髓炎模型的建立及組織蛋白酶抑制劑 cystatin F的表達

高文婷1,范 凱2,李 寧2,馬堅妹2

(1.大連醫(yī)科大學實驗動物中心,遼寧大連 116044;2.大連醫(yī)科大學解剖學教研室,遼寧 大連 116044)

[目的]研究組織蛋白酶抑制劑cystatin F在少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(MOG)35-55誘導的自身免疫性腦脊髓炎(EAE)模型中的表達。[方法]利用 MOG 35-55建立 EAE模型,通過行為學觀察對其進行神經(jīng)功能評分;利用免疫組織化學方法證明髓鞘脫失情況;通過連續(xù)切片分析,及原位雜交和免疫組化技術對小膠質(zhì)細胞活化和 cystatin F的表達進行研究。[結果]利用 MOG 35-55可成功制備EAE模型;cystatin F在正常小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)沒有表達,但在脫髓斑塊周圍可見其表達。通過系列連續(xù)切片分析,其表達與在脫髓斑塊周圍積聚的小膠質(zhì)細胞具有高度的一致性。[結論]cystatin F在MOG誘導的 EAE中具有表達,其表達與積聚的小膠質(zhì)細胞具有高度的一致性。

自身免疫性腦脊髓炎模型;脫髓鞘;cystatin F;小膠質(zhì)細胞

多發(fā)性硬化(multiple sclerosis,MS)是發(fā)生于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的自身免疫疾病,即自身免疫系統(tǒng)攻擊包裹在神經(jīng)軸突表面髓鞘所導致的脫髓鞘疾病[1]。臨床上以中、青年多見,病灶播散廣泛,其癥狀有賴于中樞神經(jīng)系統(tǒng)受累的部位,以視神經(jīng)損害最為多見,病程中常出現(xiàn)緩解/復發(fā)交替。其主要病理改變?yōu)檠仔约毎櫋⑺枨拭撌?以及髓鞘脫失后由于膠質(zhì)細胞增生而形成的硬化斑。MS屬于神經(jīng)系統(tǒng)的難治性疾病,現(xiàn)有的各種治療手段僅能起到延緩并不能阻止疾病發(fā)展。實驗性自身免疫性腦脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)與人類 MS的發(fā)病機制和病理變化極其相似,是研究MS較理想的動物模型[2]。EAE動物模型常用的致敏原多為腦或脊髓組織勻漿、髓鞘蛋白成分或其多肽片段等,其中髓鞘少突膠質(zhì)細胞糖蛋白(myelin oligodendrocyte glycop rotein,MOG)所導致的 EAE模型免疫源性高,因更能模仿人類 MS疾病過程而備受青睞[3]。

髓鞘再生一直以來被視為治療 MS最有前途的策略。髓鞘脫失過程伴有的多種神經(jīng)病理學改變中,以小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞活化最為常見,它們可以通過表達各種蛋白或細胞因子影響髓鞘再生的微環(huán)境。因此,髓鞘再生微環(huán)境的變化,即某些基因表達水平的變化,對脫髓鞘疾病具有重要影響。對此類基因的研究有助于髓鞘再生機制的闡明,對于開發(fā) MS治療性藥物具有深遠意義。

本研究以MOG35-55多肽作為抗原物質(zhì),利用C57BL/6小鼠制備 EAE模型,通過臨床評分和神經(jīng)病理學研究證實模型成功、可靠,同時針對病灶內(nèi)組織蛋白酶抑制劑 cystatin F的表達進行了分析。

1 材料和方法

1.1 材 料

SPF級 C57BL/6小鼠雌雄不拘,體重 18～20 g,25只,購自大連醫(yī)科大學實驗動物中心。20只用于制備 EAE模型,具體過程為：將 150μg MOG35-55多肽(序列為 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK,Auspep,Melbourne,Australia)溶解于含有 4mg/m L熱滅活結核分支桿菌(Sigma)的完全弗氏佐劑(complete Freund's adjuvant,CFA),注射于小鼠背部脊柱兩側(cè),分 4點皮下注射 (每只約 0.12 mL),之后立刻于腹腔內(nèi)注射百日咳毒素(pertussis toxin,PTX)400 ng,48 h后再注射 1次。其余 5只作為對照組給予正常飼育。

1.2 方 法

1.2.1 神經(jīng)功能評分：自免疫當天開始每日稱小鼠體重并觀察小鼠的精神情況。神經(jīng)功能評分方法：0分：無癥狀;1分：鼠尾張力障礙;2分：鼠尾張力障礙并且后肢力弱;3分：后肢部分癱瘓;4分：后肢完全癱瘓;5分：瀕死狀態(tài)或死亡。

1.2.2 組織取材：隨機選取免疫后第 23天 EAE小鼠 5只和正常對照組小鼠,乙醚麻醉后,剪開胸腔,充分暴露心臟,快速心內(nèi)插管,經(jīng)左心室灌注 4%多聚甲醛約 30 mL后取腦和脊髓;于 4%多聚甲醛 4℃中固定過夜,20%蔗糖置換,OCT包埋后,于冷凍切片機 18μm矢狀切片用于免疫組化和原位雜交。

1.2.3 免疫組化 ABC：利用免疫組化 ABC法檢測髓鞘堿性蛋白(Myelin Basic Protein,MBP)和 Iba1表達,以確定脫髓和小膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)。主要步驟包括：0.3%的過氧化氫溶液 30min消除內(nèi)源性過氧化物酶的影響;0.3%Triton×100(30%Triton×100+0.01mol/L PBS 100 mL)30 min增加細胞的通透性;加入一抗室溫過夜;加入生物素標記的二抗室溫孵育 2 h;加入 ABC復合物室溫孵育 2 h;二甲基聯(lián)苯胺顯色;梯度酒精脫水之后,封片,拍照。

1.2.4 原位雜交檢測 c-fms表達：切片經(jīng) 4%多聚甲醛溶液固定 20 min,20μg/mL蛋白酶 K處理30min;4%多聚甲醛溶液固定 15 min,以滅活蛋白酶 K;0.1MTEA(三乙醇胺)-HCL洗 15 min;65℃預雜交 2 h后,分別加入雜交液(地高辛標記的 cfms探針)65℃過夜;緩沖液(1×SSC和 50%甲酰胺)65℃洗 30 min×3;MABT緩沖液(100 mmol/L maleic acid,150 mmol/L NaCl,0.1%Tween-20,pH 7.5)室溫洗 30 min×2;加堿性磷酸酶耦聯(lián)的抗地高辛抗體,4℃過夜;MABT緩沖液洗室溫 30 min×3;NBT/BCIP室溫孵育至呈色良好;PBS終止反應。雜交后的切片用 Nuclear Fast Red襯染。

2 結 果

2.1 小鼠發(fā)病率及神經(jīng)功能評分

EAE模型小鼠的發(fā)病率為 100%,2只小鼠發(fā)病急劇,于免疫后 8 d之內(nèi)死亡。動物普遍在免疫后第 2天即出現(xiàn)尾張力弱癥狀,第 5天評分達到高峰,之后開始出現(xiàn)緩解,15 d后癥狀基本穩(wěn)定在 2～3分左右,一直持續(xù)至第 40天(圖 1)。

2.2 小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘脫失及小膠質(zhì)細胞活化情況

圖1 MOG誘導C57BL/6小鼠EAE的臨床過程及評分Fig 1 Clinical course ofMOG induced EAE in C57BL/6m ice(n=18)

MBP免疫組化結果顯示,正常小鼠小腦中央白質(zhì)和小腦葉間白質(zhì)均可見均勻一致的髓鞘染色(圖2A),MOG免疫后 23 d EAE小鼠可在腦內(nèi)見到斑塊狀的髓鞘脫失區(qū)域(圖 2B箭頭所示區(qū)域)。c-fms基因編碼的跨膜糖蛋白為單核細胞集落刺激因子CSF-1受體的類似物,其表達主要在單核細胞系的細胞中,包括腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞,可以作為腦內(nèi)單核吞噬/小膠質(zhì)細胞的標志物。正常動物的小腦內(nèi)可見少量、均勻的 c-fms陽性細胞存在(圖 2C),MOG免疫后可見 c-fms陽性單核吞噬/小膠質(zhì)細胞積聚于腦內(nèi)白質(zhì)區(qū)域,如小腦中央白質(zhì)、小腦葉間白質(zhì)(圖 2D)和胼胝體白質(zhì)內(nèi)(圖 2E、F),部分集中在血管的周圍(圖 2E、F)。

2.3 組織蛋白酶抑制劑 F在 EAE模型中的表達

圖2 MOG誘導的EAE小鼠免疫后 23 d的神經(jīng)病理學改變A和 C取自正常小鼠,B以及 D～F為 EAE模型小鼠。A～B為 MBP免疫組化染色;C～D為 c-fms原位雜交結果。E圖中的矩形區(qū)域被擴大為 F圖。標尺：A～E標尺為 100μm;F標尺為 50μmFig 2The neuropathological changes in EAEm ice after immunized by MOG for 23 daysA and C are from untreated mice;B,D～Fwere from EAEmice.A～B show the MBP IHC staining;C～D show the c-fms ISH,the rectangle in E is enlarged in F.Scale bar：100 μm in A～E;50μm in F

Cystatin F在正常對照組動物中無表達 (圖3C),在EAE動物模型中表達,表達的部位主要位于硬化斑周圍部(圖 3D)。連續(xù)切片研究結果顯示(n=5)cystatin F表達區(qū)域(圖 3D)與硬化斑塊周邊部的活化小膠質(zhì)細胞的分布區(qū)域具有高度一致性(圖 3A～B)。

圖3 Cystatin F表達與小膠質(zhì)細胞積聚的關系A～B,D取自 EAE小鼠連續(xù)切片,A為 Iba-1免疫組化,B為 c-fms原位雜交,D為 cystatin F原位雜交。C取自正常對照小鼠的 cystatin F原位雜交結果。標尺為 50μmFig 3 The relationship between the expression of cystatin F and the accumulation ofmacrophage/micrglia cellsA～B show the Iba1 IHC and c-fms ISH in EAEmice,respectively.C～D show the cystatin F ISH.C is from untreated mice,D is from EAE mice.Scale bar：50μm in A～D

3 討 論

MS是神經(jīng)系統(tǒng)的難治性疾病。目前,關于此疾病的研究主要利用動物模型,其中 EAE模型在發(fā)病機制和病理過程中均可最好的模仿 MS。制備 EAE可以采用多種抗原,如腦或脊髓組織勻漿、髓鞘蛋白成分或其多肽片段等。本研究采用的 MOG是位于髓鞘及少突膠質(zhì)細胞最表面的糖蛋白,有兩個跨膜區(qū)域。與其它髓鞘蛋白成分相比,如髓鞘堿性蛋白(myelin basic protein,MBP),髓鞘蛋白脂質(zhì)蛋白(proteolipid protein,PLP)等因具有免疫源性高、可誘導產(chǎn)生抗 MOG的 T淋巴細胞等特點而倍受青睞[3]。MOG既可以用于制備小鼠 EAE模型,也可用于制備大鼠的 EAE模型。其中,小鼠模型中以C57BL/6最為易感,并且沒有動物性別間的差異性[4],病程呈慢性持續(xù)狀態(tài),非常適合進行髓鞘脫失及再生機制的研究。本研究發(fā)現(xiàn),免疫后小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)白質(zhì)內(nèi)可見多個髓鞘脫失區(qū)域,同時可見 Iba1和 c-fms陽性單核吞噬/小膠質(zhì)細胞的集聚,其中一些出現(xiàn)在血管周圍,呈典型的袖套狀外觀。

Cystatin F發(fā)現(xiàn)于 1993年,別名 Leukocystatin和CMAP(cystatin-likemetastasis associated protein),屬于Ⅱ型半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族的成員。Cystatin F的表達主要見于淋巴器官,如脾臟,淋巴結等,主要存在于與抗原呈遞相關的細胞中。在某些腫瘤細胞,如白血病細胞中也有表達[5,6],有研究證明 Cystatin F在腫瘤細胞中的表達與腫瘤的轉(zhuǎn)移有一定的相關性[7,8]。本組先前的研究發(fā)現(xiàn),Cystatin F不表達于正常小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),但表達在 cuprizone誘導的髓鞘脫失模型中,并且通過原位雜交后組化研究確定了表達細胞主要為單核吞噬/小膠質(zhì)細胞[9]。然而 cuprizone是銅離子的螯合劑,是通過對少突膠質(zhì)細胞的毒性導致脫髓鞘改變的發(fā)生,與 EAE通過自身免疫機制誘發(fā)髓鞘脫失從誘發(fā)機制上具有一定的區(qū)別,因此,由 MOG誘導的 EAE模型中是否同樣具有 cystatin F的表達還是個未知數(shù)。通過本研究證實,cystatin F同樣表達在 EAE模型中,并且其表達主要位于髓鞘脫失灶的周圍,并且通過連續(xù)切片研究發(fā)現(xiàn),cystatin F表達區(qū)域與 Iba1和c-fms陽性單核吞噬/小膠質(zhì)細胞具有很強的一致性。小膠質(zhì)細胞的集聚與崩解髓鞘的吞噬作用有關,那么 cystatin F在小膠質(zhì)細胞內(nèi)的表達是否由髓鞘吞噬所誘導還需進一步證實。

Cystatin F基因在正常小鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)無表達,但表達于 MOG誘導的 EAE模型中;其表達部位與小膠質(zhì)細胞積聚部位具有高度的一致性,提示cystatin F表達與單核吞噬/小膠質(zhì)細胞對崩解髓鞘的吞噬有關。

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Establishm ent of experimentalautoimmune encephalomyelitismodel and the expression of cystatin F

GAOWen-ting1,FAN Kai2,LINing2,MA Jian-mei2
(1.Experimental Animal Center,2.Department of Anatomy,Dalian Medical University,Dalian 116044,China)

[Objective]To study the expression of cystatin F,which is cathepsin protease inhibitor,in experimental autoimmune encephalomyelitismodel induced by myelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55.[Methods]Myelin oligodendrocyte glycop rotein 35-55 was used to estab lish experimental autoimmune encephalomyelitismodel in C57BL/6mice,then clinical score was estimated by behaviou observation.Immunohistochemistrymethod was used to understand demylinating conditon in modelmice,and in situ hybridyzationmethod was performed to know the activity ofm icroglia cells and the expression of cystatin F.[Results]Experimentalautoimmune encephalomyelitismodel induced bymyelin oligodendrocyte glycoprotein 35-55 was successful.Accumu lated activatedm icroglia cellswere found around the demyelinating plaque,atmeantime cystatin F expression were also found.[Conclusion]The exp ression of cystatin F in dem yelinating disease was correlated with activated microglia cells.

experimental autoimmune encephalomyelitis;demyelination;cystatin F;microglia cells

R 512.3

A

1671-7295(2011)01-0006-05

國家自然科學基金項目(30771055);大連市優(yōu)秀青年科技人才基金項目(2008J23JH 035)

2010-11-03;

2010-12-22

高文婷(1973-),女,遼寧大連人,實驗師。E-mail：gwtpkwy@yahoo.cn

馬堅妹,教授。E-mail：ma_jianmei@hotmail.com