一貫煎對 DMN肝纖維化大鼠肝卵圓細胞增殖分化的影響

朱 英,劉 平

(1.大連醫科大學 附屬第一醫院 感染科,遼寧大連 116011;2.上海中醫藥大學 曙光醫院 肝病研究所,上海 201203)

一貫煎對 DMN肝纖維化大鼠肝卵圓細胞增殖分化的影響

朱 英1,劉 平2

(1.大連醫科大學 附屬第一醫院 感染科,遼寧大連 116011;2.上海中醫藥大學 曙光醫院 肝病研究所,上海 201203)

[目的]探討一貫煎有效逆轉大鼠肝硬化的作用途徑,促進中醫藥在組織結構重構研究中的發展。[方法]二甲基亞硝胺(DMN)制備大鼠肝硬化模型,于肝硬化造模成型后,給予一貫煎治療,以Thy1.1為肝臟卵圓細胞(HOC)標記物,通過免疫組織化學、蛋白定量檢測以及激光共聚焦檢測技術,觀察一貫煎對肝臟干細胞增殖及分化及相關因子的影響。[結果]DMN大鼠肝硬化形成過程中存在 HOC的動態變化,一貫煎組中羥脯氨酸含量減少,與模型組比較差異無顯著意義(P＞0.05)。Thy1.1與AFP共定位細胞像素密度值明顯增高,與模型組比較,差異有顯著性意義(P＜0.01),Thy1.1與 CK 19共定位細胞像素密度值略高于模型組,差異無顯著性意義(P＞0.05)。[結論]具備養陰功能的一貫煎可誘導 HOC向肝細胞分化,促進已經成型的肝硬化的逆轉,重構損傷的肝組織,從而改善肝臟功能。

一貫煎;DMN肝纖維化大鼠;肝卵圓細胞;增殖分化

肝硬化是伴隨肝臟纖維化、肝細胞損傷和肝臟功能障礙的一種慢性疾病。肝纖維化逆轉的關鍵在于病理性沉積的結締組織的降解與損傷的實質細胞的再生。干細胞的增殖、分化對肝細胞的再生起主要作用。近年來大量研究表明,在抗肝纖維化的治療中,中藥復方多環節、多層次的綜合藥理學作用具有明顯的優勢和臨床療效,同時發現中藥在干細胞誘導增殖分化方面也具有潛在的作用[1]。

本研究應用二甲基亞硝胺(Dimetlylnit nosamine,DMN)造成類似于人類的大鼠肝硬化模型[2],應用較為敏感的 Thy-1.1作為肝卵圓細胞(hepatic oval cell,HOC)標記物,觀察 HOC在肝硬化形成與消減過程中的動態變化;同時應用雙重熒光免疫激光共聚焦檢測技術觀察 HOC的分化趨向;應用一貫煎治療,觀察這些方劑在肝硬化逆轉中的作用及其對 HOC的影響,研究中醫藥在肝硬化組織重構過程中的作用與意義。

1 材料和方法

1.1 研究對象

Wistar大鼠 ,雄性,體重(160±15)g,清潔級 ,由中國科學院上海實驗動物中心提供。上海中醫藥大學實驗動物中心清潔區動物房飼養、造模和觀察,自由飲食。

1.2 主要試劑

DMN為東京化成工業株式會社產品：lot.MAL05。羥脯氨酸(Hydroxyproline,Hyp)標準品,購自日本ナカラィテスク株式會社,MIR8282。鼠抗α-SMA單克隆抗體為 Sigma公司產品;鼠抗Thy1.1單克隆抗體為 SeroTec公司產品;鼠抗 CK 19和 AFP單克隆抗體為北京中杉金橋生物技術有限公司產品;兔抗 HGF多克隆抗體為 Assay Designs公司產品;兔抗 SCF多克隆抗體為 SantaCruz公司產品;兔抗TGF-β1多克隆抗體為 Bivision公司產品。激光共聚焦檢測用 cy3標記(紅色)羊抗單克隆抗體及 FITC標記(綠色)驢抗單克隆抗體均為 Jackson Immuno Research公司產品。

1.3 藥物

一貫煎 (《柳州醫話》,由北沙參、生地、當歸 、枸杞、川楝子組成)是上海中醫藥大學附屬曙光醫院國家中醫藥管理局中藥制劑中心(國家中醫藥管理局三級實驗室)水煎濃縮煎出液制成流浸膏,冷凍干燥,閉光保存。

1.4 主要儀器

控制系統 olympus PM-30;HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統,購自同濟大千屏影像公司;復日 FR-980生物電泳圖像分析系統,上海復日科技有限公司產品。激光共聚焦顯微鏡,為日本OLYMPUS公司產品,共聚焦型號為 FV1000SIMS Scanner,所用譜線為 488 nm、543 nm兩種激光譜線,物鏡為 PLSAPO60X(數值孔徑為 1.4),顯微鏡型號為 IX81。

1.5 模型制備

Wistar大鼠 32只,雄性,重量為 (160±15)g。參照 Jenkins等[3]介紹的方法制備 DMN肝硬化模型。按 DMN 10mg/kg劑量(用生理鹽水稀釋)處理動物,腹腔注射,每周連續 3 d,1次/d,共 4周。正常對照大鼠腹腔注射同等量生理鹽水。

1.6 分組與給藥

于 DMN腹腔注射 4周造模完成后,將模型大鼠隨機分為模型對照組、一貫煎組每組 12只,正常對照組 8只。于第 5周第 1天起,一貫煎按 60 kg成人體重日劑量的 10倍量灌胃,1次/d,共 2周;正常對照組及模型對照組以同體積生理鹽水給予相應處理。

1.7 樣品的采集

大鼠予戊巴比妥鈉 40mg/kg體重劑量腹腔注射麻醉后打開腹腔,取 0.3～0.4 cm厚肝組織,OTC液包埋,液氮迅速冷凍,用恒冷切片機在 -20℃下進行 6μm厚連續冰凍切片,用于免疫組化染色。取1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm肝組織,10%中性福爾馬林液固定,24 h后逐級酒精脫水,二甲苯透明,56℃石蠟包埋,4μm厚切片,用于免疫組化染色。取肝組織 -70℃保存以備羥脯氨酸(Hyp)及 Western Blot檢測。

1.8 觀測項目與方法

1.8.1 肝組織 Hyp含量檢測：采用 Jamall氏法[3]。

1.8.2 肝組織 α-SMA、Thy1.1、HGF、TGFβ1和SCF免疫組化觀測：應用 Envision法檢測。其中Thy1.1和 TGFβ1采用冰凍肝組織切片,α-SMA、HGF和 SCF采用石蠟切片。

1.8.3 肝組織 α-SMA、Thy1.1、HGF、TGFβ1和SCF蛋白定量分析：用免疫印跡法進行檢測。

1.8.4 肝組織 AFP、CK 19與 Thy1.1共定位：采用冰凍肝組織切片,應用雙重熒光免疫共聚焦激光掃描顯微鏡技術檢測(Double Immuno Confocal Laser Scan Microscopy,DICLSM)。

1.9 統計學方法

計量資料用計算機統計軟件 SPSS10.0中的ANOVA程序進行單因素方差分析,并用 LSD程序進行兩兩比較。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 肝組織病理學的變化

2.1.1 肝組織 Hyp含量的變化：與正常對照組大鼠比較,模型對照組的肝組織 Hyp含量顯著增加(P＜0.01);與模型對照組相比,一貫煎組有所降低,但差異無顯著性意義(P＞0.05)(圖 1)。

2.1.2 肝組織 α-SMA蛋白表達的變化：α-SMA免疫組化結果顯示,終止 DMN刺激后 2周,即 6周模型對照組大鼠肝組織 α-SMA表達明顯多于正常對照組,主要表達于星狀細胞,位于匯管區、纖維間隔及肝竇部位。與模型對照組大鼠比較,一貫煎組α-SMA表達明顯減少,蛋白免疫印跡分析結果與免疫組化陽性染色動態變化趨勢一致(圖 2)。

圖1 肝組織羥脯氨酸(Hyp)含量的變化Fig 1 Change of hyd roxyp roling content in liver tissue Normal：正常組 ;Model：模型組 ;YGJ：一貫煎組

圖2 肝組織 α-SMA免疫組織化學與免疫印跡檢測Fig 2 Immunohistochem istry and Immunoblot ofα-SMA in liver tissueA：正常組(N);B：模型組(M);C：一貫煎組(J)

2.2 肝卵圓細胞標志物的變化

2.2.1 肝組織 Thy1.1蛋白表達的變化：肝組織Thy1.1免疫組化顯示,模型對照組大鼠肝組織的Thy1.1高度表達于肝臟卵圓細胞,為胞膜染色,主要位于匯管區及纖維間隔周圍,新生膽管上皮細胞明顯染色。與模型對照組比較,一貫煎組陽性染色細胞增加,蛋白免疫印跡分析結果與免疫組化染色變化趨勢基本一致(圖 3)。

2.2.2 DICLSM檢測肝組織 AFP、CK 19與 Thy1.1共定位：AFP與 Thy1.1共定位的變化：正常對照組大鼠肝組織中未見到 AFP與 Thy1.1共定位陽性細胞表達,6周模型大鼠有較多表達。與模型對照組比較,一貫煎組陽性表達量顯著增加(P＜0.01)(圖 4)。胞;A 2,Thy1.1熒光染色,無陽性染色細胞;A3,AFP與 Thy1.1共聚焦染色,無共定位染色細胞;A 4,共定位細胞密度分布為零。

圖3 肝組織Thy1.1免疫組化與免疫印跡染色Fig 3 Immunohistochem istry and Immunoblot of Thy1.1 in liver tissueA：肝臟 Thy1.1免疫組化陽性染色細胞變化(100×)。A 1：正常組(N),未見陽性染色細胞。A 2：模型組(M)終止造模后 2周,匯管區出現大量陽性染色細胞,形成團簇樣,并形成膽小管。A 3：一貫煎組(J),匯管區出現大量陽性染色細胞,多于模型組B：肝臟 Thy1.1免疫組化陽性染色細胞變化(400×)。B1：正常組(N),未見陽性染色細胞。B2：模型組(M)終止造模后 2周,匯管區出現大量陽性染色細胞,形成團簇樣,并形成膽小管。B 3：一貫煎組(J),匯管區出現大量陽性染色細胞,多于模型組

圖4 DICLSM檢測肝組織 AFP與 Thy1.1共定位Fig 4Colocalization of AFP and Thy1.1 in liver tissueA：正常組(Normal)：A 1,肝組織 AFP熒光染色,無陽性染色細

B：模型組(Model)：B1,肝組織 AFP熒光染色,出現紅色染色細胞;B2,肝組織 Thy1.1熒光染色,出現綠色染色細胞;B3,AFP與Thy1.1共聚焦染色,出現黃色共定位染色細胞;B4,共定位細胞密度分布增加。

C：一貫煎組(YGJ)：C 1,肝組織 AFP熒光染色,綠色染色細胞多于模型組;C2,肝組織 Thy1.1熒光染色,綠色染色細胞多于模型組;C3,AFP與 Thy1.1共聚焦染色,黃色共定位染色細胞多于模型組;C4,共定位細胞密度分布多于模型組。

CK19與 Thy1.1共定位的變化：正常對照大鼠肝組織中未見到 CK19與 Thy1.1共定位陽性細胞,6周模型對照組大鼠有顯著表達。一貫煎組陽性表達量與模型對照組比較,差異無顯著性意義(P＞0.05)(圖 5)。

2.3 HGF、SCF及 TGFβ1等生長因子變化

2.3.1 肝組織 HGF蛋白表達變化：正常對照組大鼠肝組織中 HGF蛋白呈較高水平表達;模型對照組大鼠僅有微量表達;與模型對照組比較,一貫煎組蛋白表達無明顯變化(圖 6)。

圖5 DICLSM檢測肝組織 CK 19與 Thy1.1共定位Fig 5 Colocalization of CK19and Thy1.1 in liver tissue

圖6 肝組織HGF免疫印記Fig 6 Immu noblot of HGF in liver tissue N：正常組;M：模型組;J：一貫煎組

2.3.2 肝組織 SCF蛋白表達變化：正常對照組大鼠肝組織中可見 SCF蛋白少量表達,模型對照組表達明顯高于正常對照組;與模型對照組比較,一貫煎組表達減少。該結果與肝組織 SCF免疫組化陽性染色變化趨勢基本一致(圖 7)。

圖7 肝組織SCF免疫印記Fig 7 Immunoblotof SCF in liver tissue N：正常組;M：模型組;J：一貫煎組

2.3.3 肝組織 TGFβ1蛋白表達變化：正常對照組大鼠肝組織中未見到 TGFβ1蛋白表達,而 DMN模型對照組有大量表達;與模型對照組比較,一貫煎組無顯著變化,接近模型對照組水平(圖 8)。

圖8 肝組織 TGFβ1免疫印記Fig 8 Immunoblot of TGFβ1 in liver tissue N：正常組;M：模型組;J：一貫煎組

3 討 論

目前,纖維化或早期硬化組織器官的結構重構成為現代生物醫學中的重大科學問題,而干細胞已成為組織器官結構重構過程中的研究焦點。現有研究顯示肝組織中存在干細胞并參與了肝細胞再生和肝損傷修復,骨髓、胚胎等多種來源的干細胞也具有向肝細胞分化的潛能,這些結果顯示了從干細胞的角度探討肝細胞再生機制及再生肝臟功能的可行性和重要性。

關于干細胞(stem cells,SC)的研究發現,肝組織中存在有肝再生的種子細胞,即肝干細胞(hepatic stem cells,HSC),這些細胞在一定的條件下,可以增生分化為肝細胞[4]。在嚴重肝損傷時,如當肝組織損傷為廣泛和慢性的或者肝細胞的增殖被抑制(如病毒感染)時,HSC被激活。在正常成年肝細胞(hepatic cell,HC)更新過程中有低水平、基礎狀態的 HSC參與分化。在胚胎發育過程中,HSC主要以成肝細胞的形式存在,而在成年組織則以卵圓細胞(hepatic oval cell,HOC)和小肝細胞(small hepatocyte-like progenitor cells,SHPC)的形式存在。在人慢性肝臟疾病中,HOC和疾病的嚴重程度有關和成熟肝細胞的增生抑制有關[5]。

本研究表明,DMN大鼠肝硬化形成過程中存在HOC的動態變化,即細胞的數量隨著肝纖維化程度的不斷加重而增加;在停止 DMN造模 2周后,即于肝纖維化開始消減時,該細胞數量的增加更為顯著,隨著肝纖維化的消減、停止 DMN造模 4周后,其數量有所減少[5]。表明 HOC的此種動態變化與大鼠肝硬化的形成與消減的病理變化有關,尤其對肝纖維化的消減具有重要病理生理意義。干細胞因子(SCF)表達對 DMN大鼠肝硬化形成與消減過程中HOC數量的動態變化具有重要作用,轉化生長因子(TGFβ1)在肝硬化形成與逆轉過程中可能起到控制HOC過度增殖的作用[6]。本實驗中,一貫煎可顯著降低血清 AST、T.Bil水平;也有一定降低肝組織Hyp含量的作用,改善肝組織炎癥和纖維化程度;減少肝組織 α-SMA的表達;提高 Thy1.1的表達,可顯著提高 Thy1.1和 AFP共定位細胞的表達。

在 DMN大鼠肝硬化模型中,一貫煎能夠降低血清 AST、T.Bil和肝組織 α-SMA水平,同時在DMN大鼠肝硬化的逆轉過程中能夠增加 Thy1.1標記的 HOC的數量,并明顯增加 Thy1.1與 AFP共定位細胞數量。表明具有養陰功效的一貫煎在 DMN大鼠肝硬化逆轉過程中,也可有效促進 HOC的活化和增殖,通過改善肝臟微環境主要誘導 HOC向肝細胞分化,同時也有誘導 HOC向膽管上皮細胞分化的作用,從而改善 DMN大鼠肝硬化的肝功能和肝組織病理,重構損傷的肝臟,以利于肝硬化的逆轉。因此,養陰一貫煎可促進 DMN大鼠肝硬化的逆轉過程中 HOC的增殖,重在誘導 HOC向肝細胞的分化。進一步深入研究該方劑誘導 HOC分化的作用機制不僅有重要的應用價值,對中醫藥基礎研究也將有重要的理論意義。

[1]慕永平,劉平,龍愛華,等.CCl4大鼠肝硬化成型階段中醫方證病機的研究[J].中國中西醫結合雜志,2006,26(4)：344-347.

[2]朱英,劉平.Thy1.1陽性肝臟卵圓細胞在大鼠肝硬化形成與消減過程中的動態表達[J].中華肝臟病雜志,2005,13(11)：823-827.

[3]Jenkins SA,Grandison A,Baxter JN,et al.A dimethylnitrosamine-inducedmodelof cirrhosis and portal hypertension in the rat[J].JHepatol,1985,1：489-499.

[4]Laurson J,Selden C,Hodgson HJ.Hepatocyte progenitors in man and in rodents-multiple pathway,multip le candidates[J].Int JExp pathol,2005,86：1-18.

[5]耿瑩,韓明子,洪鈺,等.不同移植途徑對大鼠骨髓干細胞遷移至肝臟及分化的影響[J].中華器官移植雜志,2008,29(7)：402-404.

[6]朱英,劉平.肝臟卵圓細胞定向分化在二甲基亞硝胺大鼠肝硬化消減過程中的意義[J].大連醫科大學學報,2007,29(2)：106-109.

Effect of YGJ on proliferation and differenciation of hepatic oval cells in rat cirrhosisby DMN

ZHU Ying1,LIU Ping2
(1.Department of Infectious Disease,the First Affiliatde Hospital of Dalian Medical University,Dalian 116011,China;2.Institute of Liver Disease,ShanghaiUniversity of Traditional ChineseMedicine,Shanghai 201203,China)

[Objective]Discuss effectof YGJ in cirrhosis reverse,promote development of chinese traditionalmedicine in tissue remodeling.[Methods]Ratcirrhosismodelwas set up by dimethylnitrosamine(DMN),treated with YGJaftermodeling.Thy1.1was used asmarker ofhepatic oval cells(HOCs).Immunohistochemistry,Immunoblotand DICLSM were app llied to detect effect of YGJon proliferation and differenciation of HOC and interrelated faction in rat cirrhosis.[Results]There was dynamics change during cirrhosis progress.Contentof hyd roxyp roling(Hpy)decreased in YGJ.There was significantmeaning compared with themodel(P＜0.01).Pixel density of colocalized cells of AFPand Thy1.1 was obvious higher.There was significantmeaning compared with themodel(P＜0.01),thatof CK 19and Thy1.1were slighter higher,and no significantmeaning compared with themodel(P＞0.05).[Conclusion]YGJwith function of nourishing Yin will induce HOCs differentiate into hepatocytes,promote cirrhosis reverse,rebuilt damaged liver tissue,improve liver function.

YGJ;cirrhosis of ratby DMN;hepatic oval cells(HOCs);p roliferation and differentiation

R 575.2

A

1671-7295(2011)01-0011-06

遼寧省教育廳科研項目(L2010128);遼寧省醫學高峰建設工程項目(200919);大連市科技計劃項目(2009E12SF153);大連市科技局國際合作項目(2009F11GH 178)

2010-12-08;

2010-12-15

朱 英(1965-),女,江蘇無錫人,主任醫師,博士。 E-mail：zhuuyingshu52@126.com

劉 平,教授,博士生導師。E-mail：liuliver@online.sh.cn