腸出血性大腸桿菌O157:H7研究進展

孟祥升，辛崇興，邵 晞

（江蘇省連云港市動物衛(wèi)生監(jiān)督所，江蘇連云港 222001）

腸出血性大腸桿菌（Enterohaemorrhagic Escherichia coli，EHEC）O157:H7 于 1982 年在美國被首次發(fā)現(xiàn)，此后在世界各地散發(fā)或地方流行，1996年在日本大阪地區(qū)發(fā)生流行，患者逾萬，死亡11人，1999—2000年在中國江蘇、安徽等地發(fā)生了多起食源性感染O157:H7事件，導致l77人死亡[1-2]。世界衛(wèi)生組織已將O157:H7列為新的食源性病原菌。O157:H7的感染因具有暴發(fā)流行趨勢、強烈的致病性與致死性以及抗生素治療可能會加劇病情等特點，已成為全球性的公共衛(wèi)生問題，因此對該菌進行有效的防控研究成為當前亟需解決的問題。

1 病原學

EHEC O157:H7具有一般大腸桿菌的形態(tài)特征，為革蘭氏陰性、無芽孢的直桿菌，兩端鈍圓，散在或成對，大多數(shù)菌株以周生鞭毛運動，但也有無鞭毛或丟失鞭毛的無動力變異株。在普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上O157:H7表現(xiàn)為光滑型菌落，有光澤，濕潤，灰白色。最適宜生長的溫度為37℃，超過44.5℃不能生長，在75℃一分鐘即可被殺滅，但其致病因子志賀毒素的抗力卻很高，經(jīng)80℃處理30 min仍具有活性。相對耐酸和耐冷，能在pH值為2、溫度低于5℃的環(huán)境中生存，在-20℃可存活9個月。此外，對含氯消毒劑十分敏感，在有效氯含量0.4ppm以上的水體中難以存活。

EHEC O157:H7與一般大腸桿菌的基本生化特性相符，發(fā)酵多種碳水化合物，但遲緩發(fā)酵山梨糖醇，也不能產(chǎn)生葡萄糖酸苷酶。但目前已有發(fā)酵山梨醇、產(chǎn)β-葡萄糖醛酸苷酶的產(chǎn)毒性O157:H7分離株的報道。Krishnan[3]和Haldane[4]分別報道的24株和37株O157:H7菌的生化結果，其山梨醇均為陰性，而賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫羧酶、棉子糖和衛(wèi)矛醇均為陽性，故以這5種生化特性作為O157:H7與普通大腸桿菌的鑒別要點。但葉青分離的O157:H7中2株為山梨醇陽性、棉子糖陽性，1株衛(wèi)矛醇陽性[5]。以上研究結果表明部分菌株已產(chǎn)生變異，其生化反應也不完全一致。

2 流行病學

EHEC O157:H7感染是一種動物源性傳染病，奶牛，尤其是放牧的小牛是其主要儲存宿主，從腹瀉患者、畜禽糞便、市售肉類以及豬、鴿、雞、鴨等動物中也有分離到O157:H7的報道[6]。EHEC O157:H7的流行也與季節(jié)有關，主要發(fā)生在夏秋兩季，春冬季發(fā)病相對較少，7月到8月為發(fā)病高峰期，此外，雨季也是感染的易發(fā)季節(jié)。

EHEC O157:H7可通過多種途徑傳播，其中以食源性傳播為主，水源性傳播和接觸傳播也是重要的傳播途徑。O157:H7具有較強的感染力，一般大腸桿菌需要100萬個活菌才可引起發(fā)病，而O157:H7只需100到200個活菌即可突破胃酸屏障，引發(fā)感染。各年齡段人群對O157:H7都易感，但兒童和老年人最易發(fā)病且癥狀較為嚴重，容易并發(fā)溶血性尿毒綜合癥和血小板減少性紫癜。根據(jù)現(xiàn)有的報道分析，患病后人體可產(chǎn)生免疫力，但其持續(xù)的時間較短。

3 臨床癥狀

牛是EHEC O157:H7的主要攜帶者，但成年牛一般不會發(fā)病，并且沒有臨床癥狀，只有犢牛才會出現(xiàn)腹瀉癥狀。豬感染該菌后可導致水腫病，以頭部，腸系膜和胃壁漿液性水腫為主要特征，且常伴有共濟失調(diào)，麻痹或驚厥等神經(jīng)癥狀，發(fā)病率較低但死亡率很高。對死亡小鼠進行剖檢可見整個腸道腸壁菲薄，透明腫大有氣泡，充血、出血，充滿黃色液體，其中尤其以十二指腸最為嚴重；肝臟灰白色點狀壞死，周邊淤血；心、肺、脾、腎點狀出血等。

人對EHEC O157:H7普遍易感。流行病學統(tǒng)計研究表明該病的潛伏期通常為3~4 d，短則1~2 d，長則5~8 d，多數(shù)出血性結腸炎患者發(fā)病后10 d內(nèi)即可自愈。臨床資料統(tǒng)計表明，EHEC O157:H7感染患者大多急性發(fā)病，常突然發(fā)生劇烈腹痛和非血性腹瀉，數(shù)天后出現(xiàn)血性腹瀉，低熱或不發(fā)熱。表現(xiàn)為水樣便、粘液便或膿血便，在有的病例中，取得的糞便樣品甚至是“只有血沒有糞渣”，可見出血性腹瀉的程度。

4 檢測方法

EHEC O157:H7感染已成為全球性的公共衛(wèi)生和食品安全問題，對其進行快速、特異的檢測對于該病的早期診斷及疫情有效控制至關重要。生物技術的發(fā)展為EHEC O157:H7的實驗室診斷提供了許多有效的手段和方法。

4.1 細菌分離法

國內(nèi)有報道稱可以使用顯色培養(yǎng)基對EHEC O157:H7進行初篩，目前常規(guī)使用山梨醇麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（SMAC）對菌株進行分離和篩選，在正常條件下，EHEC O157:H7不能發(fā)酵山梨醇，在SMAC瓊脂上呈現(xiàn)為無色或者灰色菌落，而其他大腸桿菌則呈紅色菌落[7]。但有一些其他血清型的O157和變形菌、毗鄰單胞菌屬、摩根菌屬和愛德華菌屬等革蘭氏陰性菌也不發(fā)酵山梨醇。后又根據(jù)頭孢克肟抑制變形菌，O157型菌株不能發(fā)酵鼠李糖，而60%的山梨醇陰性的其他O157發(fā)酵鼠李糖等而制備了頭孢克肟-鼠李糖-山梨醇麥康凱培養(yǎng)基（cefixime rhamnse sorbitol MaConkey agar CR-SMAC），提高了分離的敏感性。

4.2 血清學檢測方法

EHEC O157:H7經(jīng)初步分離培養(yǎng)后需要進一步通過血清學實驗進行鑒定，目前常用的血清學診斷方法有玻片凝集試驗、乳膠凝集試驗和ELISA法等。玻片凝集試驗常常出現(xiàn)假陰性的結果。乳膠凝集試驗可以直接從廠家購買乳膠凝集試劑盒按兩步法進行檢測，具體步驟為挑取分純的菌株分別與O157、H7診斷血清做凝集試驗。凡與O157單克隆抗體凝集達++以上者，再用H7血清凝集。若H7鞭毛抗原發(fā)育不良，可用0.3%~0.4%半固體瓊脂做U型管誘導鞭毛產(chǎn)生，然后再進行凝集，凝集++以上者可初步判定為EHEC O157:H7菌株。目前實驗室最常用的血清學檢測方法是ELISA法，利用全菌體、LPS和Stx等抗原檢測血清中相應的抗體水平。宿主感染EHEC后，一般都會誘發(fā)抗LPS抗體，所以在血清學檢測上，一般都是檢測抗LPS的抗體。

4.3 免疫學檢測方法

4.3.1 免疫磁珠法 基本操作是先將標本進行選擇性增菌，然后加入EHEC O157:H7抗體包被的磁珠，37℃振搖培養(yǎng)30 min，再用磁板將免疫磁珠沉淀，從而分離得到EHEC O157:H7。

4.3.2 蛋白芯片檢測法 基本操作是首先將抗原（或抗體）固定于膜、載玻片等載體上制成檢測用芯片，然后用該芯片去捕捉待檢樣品中的特異性抗體（或抗原），最后加入熒光標記的二抗，經(jīng)激光共聚焦掃描儀或熒光掃描儀掃描，記錄芯片上各點的熒光強度，從而對樣品進行判定。

4.3.3 膠體金免疫層析試紙檢測法 當前國內(nèi)外多以雙抗體夾心法檢測樣品中的EHEC O157:H7菌體（O）抗原。用膠體金標記抗EHEC O157:H7的單克隆抗體，然后與樣品中的EHEC O157:H7結合，形成雙抗體夾心結構，呈現(xiàn)出肉眼可見的紅色條帶。該法靈敏度高、特異性強，操作簡便、快速，結果準確、易于判讀。

4.4 分子生物學檢測法

4.4.1 PCR技術 目前常用的PCR技術為實時熒光定量PCR，該PCR法：除具有比常規(guī)PCR更好的特異性和敏感性外，還能對樣本進行定量，準確反應出污染或感染的強度，在病原體檢測中顯示出很強的優(yōu)勢。Karen[8]等在FQ-PCR的基礎上建立了目的基因為stx1、stx2和uidA的檢測EHEC O157:H7多重實時熒光PCR方法，敏感性達到98.6%，特異性100%，具有較好的應用前景。

4.4.2 基因芯片技術 基因芯片技術又稱為DNA芯片技術，是近年來分子生物學及醫(yī)學診斷技術的重要進展，該技術能高效大規(guī)模的獲取相關的生物信息，是一種重要的基因檢測手段。Call等[9]將EHEC O157:H7 編碼 Intimin，Stx1，Stx2 和 HeamolysinA 等4種毒力因子的25~30 mer寡核苷酸探針固定在玻片上，模板DNA可直接與之雜交。與普通凝膠電泳法相比該方法靈敏度提高了30倍，能夠檢測小于1個細胞的基因組DNA量的PCR擴增產(chǎn)物（1fg）。

4.4.3 生物傳感器技術 生物傳感器是將生物芯片和傳感技術結合在一起的產(chǎn)物，是現(xiàn)代科技的前沿技術之一，具有選擇性高、分析速度快、操作簡易和價格低廉等特點，可以進行在線或活體分析。Demarco[10]設計制造了一種消散波光纖生物傳感器，利用該生物傳感器分別檢測l0 g和25 g碎牛肉樣品中的細菌污染情況。結果顯示l0 g樣品的檢測靈敏度為5.2×102cfu/g，25 g樣品的檢測靈敏度為9.0×103cfu/g，并且在處理樣品的25 min中內(nèi)沒有出現(xiàn)任何假陽性結果。該方法靈敏、重復性好，特異性也較為理想。

5 防控策略

近年來世界各地EHEC O157:H7的流行范圍不斷擴大，受到世界各國衛(wèi)生組織的高度重視。目前，對EHEC O157:H7的自然攜帶宿主及該菌引起的感染尚缺乏有效的防治手段，國家衛(wèi)生部規(guī)定EHEC O157:H7感染患者和疑似病人禁止使用抗生素進行治療。臨床研究證明，用磺胺類和內(nèi)酰胺類抗生素對EHEC O157:H7感染患者進行治療，會增加患者并發(fā)HUS的危險性[11]。因此對該菌的防控就顯得尤為重要，除消滅傳染源、切斷傳播途徑外，近年來EHEC O157:H7疫苗的研究對該病的防控也起到了重要的作用。

5.1 消滅傳染源

牛和其他少數(shù)反芻動物是EHEC O157:H7的主要的儲存宿主，從豬、鴿、牛、雞、鴨等動物中也有分離到EHEC O157:H7的報道。一些方法已被用于減少該菌在牛腸道中的定居，如調(diào)整飼料配比、應用微生態(tài)制劑以及使用噬菌體消滅該菌等。由于該菌引起的感染大多由環(huán)境污染而來，所以對帶菌動物排泄物的處理也十分重要。通過發(fā)酵糞便的方法殺滅EHEC O157:H7，能大大降低其存活數(shù)量。

5.2 切斷傳播途徑

由于人與帶菌動物接觸也會導致EHEC O157:H7的感染，所以農(nóng)場的工作人員及其他與之有接觸的人員應采取適當?shù)姆雷o措施，并注意個人衛(wèi)生，不在飼養(yǎng)動物的地方用餐。避免糞便污染水源，保持水源清潔。在食品加工、零售的各個環(huán)節(jié)要嚴格遵守食品衛(wèi)生法規(guī)，并要加強對動物性食品的微生物學檢測。

5.3 免疫預防

研究表明，EHEC O157:H7被巨噬細胞吞噬后并不能在短時間內(nèi)被消滅掉，在這段時間內(nèi)，Stx在菌體內(nèi)的表達量反而會迅速增加，該菌被溶酶體裂解后，產(chǎn)生的Stx又會被巨噬細胞釋放出來，同時巨噬細胞產(chǎn)生的炎性細胞因子、IL和TNF等也會一起被釋放出來，導致病理反應的增強[12]。因此，有效的免疫預防是控制EHEC O157:H7感染的最好策略，其中疫苗接種為免疫預防的重要手段之一。目前對EHEC O157:H7疫苗的研究主要集中在多糖結合疫苗、亞單位疫苗、轉基因植物疫苗、細菌ghost疫苗、減毒活菌苗和重組載體活菌苗等幾個方面，一些疫苗已取得了重大進展，進入臨床實驗階段。但EHEC O157:H7疫苗真正應用于臨床免疫防治還有待時日，許多問題有待解決，如篩選最佳抗原或抗原組合、尋找高效、安全的佐劑或研制不需要佐劑的疫苗和建立更接近人體免疫狀況的動物模型等。相信經(jīng)過科研人員的不懈努力，用疫苗來防治EHEC O157:H7的感染將變?yōu)楝F(xiàn)實。

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