神經(jīng)組織染色方法的研究概況

顧 兵，金建波，李華南，王爍宇

(1.江西科技師范學院，江西 南昌 330013;2.江西中醫(yī)學院，江西南昌 330006)

神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative diseases)是由大腦或脊髓的神經(jīng)元或其髓鞘的喪失所致，隨著時間的推移而惡化，以導致功能障礙［1］。采用常規(guī)染色技術(shù)，如HE染色，疾病的某些特殊病理變化難以完全準確的顯現(xiàn)，而借助一些特殊染色可對某一特定結(jié)構(gòu)改變進行選擇性的浸染。但是，由于后者染色步驟過于復雜，流程相對繁瑣，受外界因素的干擾比較大，經(jīng)常導致染色結(jié)果的不穩(wěn)定，進而難以反映病理改變。目前，系統(tǒng)介紹神經(jīng)組織染色技術(shù)進展的文獻甚少，使得神經(jīng)病理學研究人員，尤其是初學者，難以領(lǐng)會各種染色方法的精髓。根據(jù)浸染組織的不同，將神經(jīng)組織染色分為尼氏染色、神經(jīng)元染色、神經(jīng)膠質(zhì)細胞染色、髓鞘染色、突觸染色和神經(jīng)纖維染色6種。本文就發(fā)展成熟的神經(jīng)組織染色方法原理、優(yōu)缺點及其病理學應用作一綜述，并簡述其在神經(jīng)退行性疾病研究中的應用，旨在指導研究者選用合適的染色方法。

1 尼氏染色(Nissl staining)

尼氏染色方法是德國病理學家Nissl于1892年創(chuàng)立，其主要根據(jù)是神經(jīng)元胞體內(nèi)含有大量嗜堿性的尼氏小體。當組織與某些堿性染料(甲粉紫、甲苯胺藍、硫堇、焦油紫等)作用時，細胞中的尼氏體能夠選擇性與其結(jié)合而著色。Lindroos［2］對尼氏染色方法進行了改良，并應用于顱腦組織切片的病理研究。改良后的方法大大縮短了染色時間，且胞內(nèi)細胞核，尼氏體均能清晰可見。雖然尼氏染色法既可清晰辨別尼氏體以及胞核、核仁［3］，又很容易區(qū)分軸突和樹突，但該法僅應用于腦，脊髓等尼氏體較為豐富的組織。尼氏體受染后呈塊狀(形如虎斑)或顆粒狀，核周圍尼氏體顆粒較大，近邊緣處較小而細長。在神經(jīng)元受損時，尼氏體的數(shù)量可減少甚至消失，因此根據(jù)形狀大小和數(shù)量差異，可判別神經(jīng)損傷程度。Simon等［4］報道促紅細胞生成素對豬缺血/再灌注損傷的治療作用。經(jīng)尼氏染色、HE染色和TUNEL免疫組化染色證實，脊髓胸段神經(jīng)元損傷以及凋亡得到緩解。Pinzon等［5］分別采用動物行為學和尼氏染色評價二甲胺四環(huán)素對脊髓挫傷大鼠的神經(jīng)保護作用。施用二甲胺四環(huán)素后，大鼠BBB評分和組織病理學均有改善。缺點是組織未干燥完全，易發(fā)生嚴重皺縮。其次，切片之后易使組織破裂，影響觀察。

2 神經(jīng)元染色(neuron staining)

神經(jīng)元染色主要分為鍍銀染色和FJ染色(Fluoro jade staining)兩種方法。鍍銀染色是由Golgi于1873年建立并成功應用于神經(jīng)元的特異性染色技術(shù)。由于神經(jīng)元具有較強的嗜銀性，當組織處于含有銀離子的溶液中，神經(jīng)元可選擇性地浸染銀離子。然后通過甲醛溶液可將沉積在組織中的銀離子還原為銀顆粒，從而使神經(jīng)元著色。但是，Golgi法只能浸染所有神經(jīng)元細胞，難以辨別潰變的神經(jīng)元。Carlsen等［6］發(fā)現(xiàn)組織切片經(jīng)過銅銀溶液浸染后，正常神經(jīng)元被抑制染色，從而區(qū)分出潰變神經(jīng)元，且染色結(jié)果背景清晰，潰變神經(jīng)元及其軸突結(jié)構(gòu)完整。Tenkova等［7］在此基礎(chǔ)上對鍍銀染色進行了改進，使組織切片在4%多聚甲醛溶液中保存時間延長至6個月，仍具較好染色效果，染色結(jié)果背景呈金黃色。因而，該方法在神經(jīng)退行性疾病研究方面被諸多學者所親睞。Hall等［8］利用銅銀染色技術(shù)對控制性皮層撞擊小鼠進行定量影像分析，同時對神經(jīng)元退變程度的空間性和時程性作了比較完整的闡述。Macauley等［9］報道了PPT1(一種棕櫚蛋白質(zhì)硫酯酶)缺陷小鼠的小腦病理和運動障礙的結(jié)果。經(jīng)過銅銀染色后，發(fā)現(xiàn)PPT1缺失后大鼠神經(jīng)元退變程度明顯增加。但由于試劑成本較高，染色步驟較為繁瑣，耗時較長，不宜批量制作標本，并且所需器皿均需潔凈，否則影響染色結(jié)果。此外該染色技術(shù)通常采用多聚甲醛溶液及二甲胂酸緩沖液對標本進行灌注固定，且固定時間均需完全，否則神經(jīng)元不易被浸染或浸染不完全［10］，因此國內(nèi)報道較少。

FJ染色是近年來新興的一種神經(jīng)元染色技術(shù)［11］。Fluoro Jade染料對變性神經(jīng)元具有很高親和力，在紫外線照射條件下，壞死神經(jīng)元顯現(xiàn)藍色熒光，由此對損傷神經(jīng)元進行定性，定量研究。FJ染色不僅可選擇性地標記腦及脊髓組織切片上變性神經(jīng)元的胞體、樹突和軸突，而且能顯示腦內(nèi)神經(jīng)細胞凋亡和組織中淀粉樣蛋白沉積。FJ染色除了能浸染潰變神經(jīng)元外，還可以用于退變有髓纖維束的追蹤，如視神經(jīng)束等。目前用于退變神經(jīng)元染色的FJ染料主要有FJ、FJB和FJC三種。與FJ和 FJB染料相比［12］，F(xiàn)JC染料效果更優(yōu)，親和力更高，染色時間短，所需濃度低。此外，其還可與其它熒光素標記物結(jié)合進行多重熒光染色。Chidlow等［13］采用FJC和DAPI(一種能夠與DNA強力結(jié)合的熒光染料)熒光雙染技術(shù)評價大鼠視網(wǎng)膜和視神經(jīng)纖維損傷后神經(jīng)元退變情況。Mechírová 等［14］探討脊髓缺血/再灌注后神經(jīng)元退變，試驗前預先施用去甲腎上腺素和銀杏葉乙醇提取物EGb761的家兔，F(xiàn)JB染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注后大鼠脊髓側(cè)角Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ對陽性神經(jīng)元明顯下降。

3 神經(jīng)膠質(zhì)細胞染色(Glial staining)

3.1 星形膠質(zhì)細胞 Cajal法染色是一種選擇性浸染星形膠質(zhì)細胞的染色技術(shù)。原理是切片經(jīng)氯化金升汞溶液浸染，然后通過亞硫酸鈉溶液使星形膠質(zhì)細胞著色穩(wěn)定。缺點是染液需臨用前配制，不易保存，染色耗時長，染色結(jié)果不穩(wěn)定。Kitch等［15］建立的星形膠質(zhì)細胞染色方法，能選擇性地浸染原生質(zhì)型或纖維型星形膠質(zhì)細胞的胞體，而對其他膠質(zhì)細胞的浸染具有抑制作用。但對于Ⅱ型阿爾采末病引起的星形膠質(zhì)細胞病變狀態(tài)難以浸染。楊壯來在Cajal法染色的基礎(chǔ)上對組織的切片，固定，浸染等步驟進行了修改。改良后的方法使纖維型星形膠質(zhì)細胞染色均勻，背景淺，染色時間明顯縮短。許多神經(jīng)退行性疾病，如帕金森病、阿爾采末病，常與腦內(nèi)神經(jīng)細胞，尤其是星形膠質(zhì)細胞的損傷(或退化)，腦中神經(jīng)纖維叢的出現(xiàn)以及類淀粉斑有關(guān)。鄧廣斐等采用將神經(jīng)毒素MPTP注入C57BL/6小鼠腹腔建立帕金森病動物模型。經(jīng)碳酸銀染色發(fā)現(xiàn)，帕金森病模型組星形膠質(zhì)細胞增生與激活明顯。

3.2 小膠質(zhì)細胞 1963年Naoumenko等報道采用碳酸銀法浸染小膠質(zhì)細胞，再經(jīng)過甲醛溶液還原使銀沉積在組織切片上。與常規(guī)HE染色相比，碳酸銀染色能夠顯現(xiàn)出胞體及其突起。但碳酸銀見光易分解，不易保存。但后來Gallyas報道的銀染法具有組織可于甲醛溶液中保存數(shù)年，適用于多種標本的取材，包括冰凍切片、石蠟切片等，可批量進行染色操作，浸染過程可在鏡下操作便于控制染色時間等優(yōu)點。鄭翔等將組織標本由原來的火棉膠處理改為石蠟處理。雖然準確穩(wěn)定的浸染出小膠質(zhì)細胞，但仍存在一些缺陷，如切片厚度不能太厚，背景過深等。于騰波等探討活化的小膠質(zhì)細胞移植治療大鼠脊髓中度損傷的療效。碳酸銀染色和BBB評分結(jié)果顯示:移植組比同期對照組陽性細胞數(shù)明顯增多，移植組術(shù)后后肢運動功能評分較對照組明顯升高。

3.3 少突膠質(zhì)細胞 少突膠質(zhì)細胞染色原理與其他鍍銀染色技術(shù)相類似，主要依據(jù)神經(jīng)細胞嗜銀性。1930年P(guān)enfield采用Del Rio-Hortega’s改良法成功浸染出少突膠質(zhì)細胞。該法對脊髓，腦干及顱腦白質(zhì)區(qū)域的少突膠質(zhì)細胞浸染可靠性好，并且還可選擇性浸染外周神經(jīng)施萬細胞的髓鞘，但染色背景較粗糙，影響觀察。1948年Grino等將鎢酸鈉添加至硝酸銀溶液中，使少突膠質(zhì)細胞的呈現(xiàn)更為清楚。少突膠質(zhì)細胞對氧具有特殊的親和力，經(jīng)過過氧化氫溶液處理后，激活了少突膠質(zhì)細胞內(nèi)的碳酼基而發(fā)生顯色反應。但此法對于細胞突起的顯示不夠清晰，操作比較繁瑣。姚竹秀將Grino法進行改進，采用Peufield染色法所用的固定劑固定組織，得到較好的染色結(jié)果，并認為固定劑成分和酸堿度對染色的成敗大有關(guān)系。馬廷賢將銀溶液中的碳酸鈉濃度調(diào)至飽和，用DAB和H2O2對切片進行預處理，同時把浸染的時間延長和溫度升高，染色結(jié)果穩(wěn)定性和成功率大為提高。細胞形態(tài)顯現(xiàn)的原因可能是DAB對銀離子具有吸附作用，使其在膠質(zhì)細胞的胞體和突起上沉積而顯色。

4 髓鞘染色(myelin staining)

髓鞘是包裹在神經(jīng)細胞軸突外面的一層膜。神經(jīng)纖維受損時，如多發(fā)性硬化癥，腦脊髓炎等疾病均可導致髓鞘的變形，崩解或脫失。目前常用髓鞘染色方法有媒染法，利用鋨酸與類脂質(zhì)的特殊反應和油溶性染料浸染法3種。媒染法主要是因為經(jīng)鉻鹽或鐵礬媒染的磷脂(髓鞘主要成分)易與蘇木素結(jié)合而著色，具有操作簡單，試劑便宜的優(yōu)點。但染色結(jié)果對比度差、且分化不易掌控，較難被初學者所掌握。鋨酸與類脂質(zhì)的特殊反應主要原理是:將類脂質(zhì)組織(磷脂)固定于鋨酸溶液后，能被氧化成黑色體，由此特異性鑒別髓鞘。經(jīng)鋨酸固定后的類脂質(zhì)組織不會被脂溶性溶劑溶解，提高了結(jié)果準確性。但鋨酸價格昂貴，且不易久存;其次因浸透性差，經(jīng)常造成組織背景模糊，不易觀察。油溶性染料主要是指Luxol固藍，是Kluver等［16］于1953年將其應用于髓鞘染色。Luxol固藍在乙醇溶液內(nèi)具有與髓鞘磷脂結(jié)合染色的特性，如再經(jīng)過中性紅或焦油紫復染，不僅對髓鞘著色有一定的強化效應，而且還可浸染神經(jīng)元的胞核及尼氏體。Luxol固藍染色能夠浸染髓鞘束和單一髓鞘纖維，髓鞘著色鮮明，背景清晰。呂廣明認為該法對于鑒定神經(jīng)髓鞘的特異性具有良好的標記作用，常用于顯示髓鞘含量豐富的神經(jīng)傳導束，如皮質(zhì)脊髓束。此外，也可用來分析髓鞘再生及脫髓鞘的程度［17］。與媒染法、鋨酸染色法相比，對比度明顯提高，特異性好，但試劑較貴，不易購買。在研究神經(jīng)退行性疾病中，髓鞘染色通常與尼氏染色相結(jié)合，使結(jié)果對比鮮明。Chen等［18］探討3，4二羥苯基乳酸(DLA)對脊髓壓迫損傷后的炎癥影響。Luxol固藍和Nissl染色結(jié)果顯示，經(jīng)DLA施用后的大鼠，傷后d 10髓鞘退變緩慢。朱桂彬等利用改良的Marsland銀染法與Luxol固藍雙重染色觀察人老年癡呆癥尸檢腦組織。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦組織中老年斑呈均質(zhì)的嗜銀團，神經(jīng)元纖維增粗，扭曲形成纏結(jié)清晰可見，且染色背景清晰，幾無銀顆粒沉淀。

5 突觸染色(synapse staining)

目前有兩種顯示神經(jīng)突觸的方法。鍍銀染色法通常采用Cajal染色法和Golgi染色法來顯示突觸，其主要根據(jù)突觸的嗜銀性而使突觸著色［19］。但由于過程繁瑣，染色結(jié)果不穩(wěn)定而未被廣泛使用。Singh［20］通過改良鍍銀染色發(fā)現(xiàn)，大鼠傷后d 7即可在神經(jīng)纖維網(wǎng)齒狀回觀察到少量退變突觸。楊壯來將Cajal法進行改良并成功顯示神經(jīng)突觸。改良后的方法具有神經(jīng)突觸及包體內(nèi)神經(jīng)元纖維染色清晰，方法簡單，穩(wěn)定，切片可長久保存而不退色的特點。磷鎢酸染色法是利用重金屬浸染神經(jīng)突觸，然后通過電鏡觀察突觸結(jié)構(gòu)及數(shù)量變化。缺點是組織固定時需采用鋨酸，毒性較強，且價格昂貴。Shankar等［21］通過磷鎢酸染色證實，突觸結(jié)構(gòu)及機能的可塑性變化與學習，記憶功能有著密切聯(lián)系。韓玉澤等借助磷鎢酸染色電鏡觀察患有克汀病的大鼠小腦突觸分布，發(fā)現(xiàn)顆粒層中突觸數(shù)目較少，且形成不全。

6 神經(jīng)纖維染色(nerve fiber staining)

神經(jīng)纖維染色也是依據(jù)神經(jīng)纖維對銀離子的特殊吸附性，但方法不同。1904年Bielschowsky等通過甲醛溶液將吸附于神經(jīng)纖維內(nèi)的銀復合物還原生成棕黑色鉻銀沉淀，但難以浸染潰變的神經(jīng)纖維。Fink等［22］將組織切片依次浸入高錳酸鉀、草酸和苯二酚混合液、硝酸鈾進行預處理，選擇性浸染出潰變的神經(jīng)纖維。但由于銀顆粒易在正常組織中沉積，造成切片背景不清晰、潰變纖維及其終末不易辨別的缺陷。隨后，De Olmos［23］將組織切片先經(jīng)銅銀溶液處理，抑制正常神經(jīng)纖維浸染。該法具有染色背景清晰，潰變纖維結(jié)構(gòu)明顯可見的特點。畢彥忠等將氨銀溶液的配置方式進行簡化，使神經(jīng)纖維浸染及背景更為清晰，同時操作簡單，節(jié)省試劑成本。此外，何金鑫等報道固定液的選擇對神經(jīng)纖維染色有一定的影響，其中丙酮固定后染色效果最好。Gallyas［24］將潰變神經(jīng)纖維染色法應用于阿爾采末病等神經(jīng)退行性疾病的病理診斷研究。與Bodian染色法相比，該法可抑制正常神經(jīng)組織浸染，僅對神經(jīng)元纖維纏結(jié)、膠質(zhì)細胞變性，包涵體等異常結(jié)構(gòu)選擇性染色。

神經(jīng)退行性疾病除了引發(fā)神經(jīng)組織自身受損外，亦會引起一些神經(jīng)毒性物質(zhì)和蛋白的異常表達。如Tau蛋白、GFAP和CR3分別為少突膠質(zhì)細胞、星形膠質(zhì)細胞及小膠質(zhì)細胞受損的特異性標識物［25］。髓鞘堿性蛋白(MBP)是由少突膠質(zhì)細胞分泌。當MBP大量丟失會引起髓鞘受損，進而引起軸突受損。因此，除了神經(jīng)組織染色技術(shù)外，免疫組織化學，免疫沉淀反應等技術(shù)同樣在顯示其病變結(jié)構(gòu)研究中扮演著重要角色。它是利用抗原抗體反應與形態(tài)學結(jié)合，對組織中的抗原做定性、定量、定位檢測，具有操作簡單，靈敏度高的特點。缺點是抗原活性容易丟失，或者存在非特異性染色而影響結(jié)果判定。總而言之，一種準確、可靠的神經(jīng)組織染色方法，需要具備被染對象特異性高、操作簡便、試劑價格低廉、無毒、靈敏度高及穩(wěn)定性好等特點。

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