前列腺癌雄激素依賴轉(zhuǎn)化后雄激素受體基因表達(dá)變化的研究

潘壽華 閻家峻 鄭專

紹興市人民醫(yī)院泌尿外科，浙江 紹興 312000

雄激素阻斷是晚期前列腺癌首選治療方法，但一般經(jīng)12～18個(gè)月的治療后會轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆郧傲邢侔颊咦罱K往往死于雄激素不敏感癌細(xì)胞的廣泛轉(zhuǎn)移［1］。前列腺癌這種雄激素依賴性轉(zhuǎn)化的機(jī)制目前尚不完全清楚，本研究主要從AR基因表達(dá)水平變化方面來探討前列腺癌雄激素依賴轉(zhuǎn)化的可能機(jī)制，為雄激素非依賴性前列腺癌的臨床治療提供理論基礎(chǔ)。

1 資料和方法

1.1 臨床資料

所有病例均為在本院治療的晚期前列腺癌患者，共33例，均符合以下條件：⑴治療前均經(jīng)病理和影像學(xué)檢查確診為C或D期的前列腺癌患者。⑵均接受正規(guī)抗雄激素治療，方法包括雙側(cè)睪丸切除或皮下注射醋酸亮丙瑞林(商品名抑那通，日本武田制藥公司生產(chǎn))、口服比卡魯胺(商品名康士得，英國阿斯利康公司生產(chǎn))。⑶隨訪期間根據(jù)需要能前后2次獲取前列腺癌組織標(biāo)本。根據(jù)是否發(fā)生雄激素依賴轉(zhuǎn)化的標(biāo)準(zhǔn)［2］分為雄激素依賴轉(zhuǎn)化組和雄激素依賴無轉(zhuǎn)化組。雄激素依賴轉(zhuǎn)化組：18例，年齡59～82歲，平均年齡69歲。內(nèi)分泌治療時(shí)間為13～36個(gè)月，發(fā)生雄激素依賴轉(zhuǎn)化時(shí)間為12～24個(gè)月。雄激素依賴無轉(zhuǎn)化組：15例，年齡60～81歲，平均年齡70歲。內(nèi)分泌治療時(shí)間為12～35個(gè)月。

1.2 RT-PCR法測定前列腺癌中AR基因表達(dá)

提取細(xì)胞總RNA，RT-PCR反應(yīng)步驟：0.5 mL離心管中加入4 μg總RNA，Oligo(dT)18 μL，加DEPC處理水至12 μL，70 ℃溫育5 min后取出冰浴，依次加入5×反應(yīng)緩沖液4 μL，10 mmol/L dNTP 2 μL，RNA酶抑制劑1 μL(20 U)，37 ℃溫浴5 min后，加1 μL(200 U)M-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶，混勻后42 ℃ 溫浴1 h，70 ℃滅活10 min。PCR反應(yīng)體系為2×反應(yīng)緩沖液12.5 μL、引物正反義鏈各0.5 μL、模板DNA 2 μL以及DEPC處理水9.5 μL至終體積25 μL。AR的反應(yīng)參數(shù):93 ℃預(yù)變性3 min，93 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s；29個(gè)循環(huán)， 72 ℃終延伸10 min。β-actin的反應(yīng)參數(shù):94 ℃預(yù)變性3 min， 94 ℃變性45 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s；29個(gè)循環(huán)，72 ℃終延伸5 min。AR引物正義鏈：5’-GCAATCATTTCTGCTGGCGCA-3’，反義鏈：5’-AGCTACTCCGGACCTTACG-3’。β-actin正義鏈：5’-GTGGGGCGCCCCAG GCACCA-3’，反義鏈：5’-CTTCCTTAATG TCACGCACGATTTC-3’，引物由上海生物工程公司合成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

兩組數(shù)據(jù)均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

33例前列腺癌患者在研究期間有18例患者發(fā)生了雄激素依賴轉(zhuǎn)化，發(fā)生時(shí)間為(18±5)個(gè)月，15例患者未發(fā)生雄激素依賴轉(zhuǎn)化。采用RT-PCR法檢測AR基因在雄激素依賴轉(zhuǎn)化組及無轉(zhuǎn)化組前列腺癌細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況，雄激素依賴轉(zhuǎn)化組轉(zhuǎn)化后AR基因表達(dá)水平明顯高于轉(zhuǎn)化前［(36.7±1.8) Ctvs(28.4±3.4) Ct，t=14.43，P＜0.001］，而雄激素依賴無轉(zhuǎn)化組AR基因表達(dá)水平無明顯變化［(29.1±3.2) Ctvs(29.5±3.1) Ct，t=0.409，P＞0.05］。

3 討 論

前列腺癌雄激素依賴發(fā)生轉(zhuǎn)化的分子生物學(xué)機(jī)制仍不十分明了，但目前比較一致的看法是AR在這一過程中有著重要的作用［3］。過去人們曾通過研究前列腺癌的體外模型發(fā)現(xiàn)前列腺癌雄激素依賴發(fā)生轉(zhuǎn)化后常伴有AR蛋白表達(dá)下調(diào)或缺失，認(rèn)為晚期前列腺癌經(jīng)內(nèi)分泌治療一段時(shí)間后表達(dá)AR的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，而缺乏AR表達(dá)的腫瘤細(xì)胞選擇性的過度克隆增殖是導(dǎo)致前列腺癌雄激素依賴發(fā)生轉(zhuǎn)化的重要原因［4］。Chodak等［5］用半定量方法檢測AR在前列腺癌中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，AR的表達(dá)量與前列腺癌分化程度呈負(fù)相關(guān)，Greenberg等［6］在前列腺癌轉(zhuǎn)基因鼠動(dòng)物模型中亦觀察到相似的結(jié)果。國內(nèi)張秉鴻等［7］使用免疫組化及圖像分析技術(shù)檢測前列腺癌中AR的含量也發(fā)現(xiàn)，隨著前列腺癌惡性程度增加，AR表達(dá)減少，發(fā)生雄激素依賴轉(zhuǎn)化后AR表達(dá)較轉(zhuǎn)化前明顯下降，而AR表達(dá)與前列腺癌的臨床分期無明顯相關(guān)性。

隨著分子生物學(xué)技術(shù)及AR基因檢測技術(shù)的不斷進(jìn)展，近年來許多研究卻發(fā)現(xiàn)了與過去截然不同的結(jié)果。Linja等［8］使用實(shí)時(shí)RT-PCR法檢測一組前列腺癌標(biāo)本發(fā)現(xiàn)，雄激素依賴轉(zhuǎn)化的病例AR轉(zhuǎn)錄水平較抗雄激素治療有效的病例高6倍，Brown等［9］應(yīng)用FISH法檢查18例雄激素依賴轉(zhuǎn)化前列腺癌中的AR基因和9例原發(fā)腫瘤AR基因情況，發(fā)現(xiàn)9/18的雄激素依賴轉(zhuǎn)化前列腺癌有AR基因的擴(kuò)增，而未治療的原發(fā)前列腺癌中無AR基因的擴(kuò)增，Chen等［10］證實(shí)雄激素依賴轉(zhuǎn)化的前列腺癌中AR cDNA、mRNA、蛋白的表達(dá)均高于雄激素依賴前列腺癌，Koivisto等［11］使用比較基因組雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)有30%雄激素依賴轉(zhuǎn)化前列腺癌有AR基因擴(kuò)增，國內(nèi)張勇等［12］采用RBA法研究證實(shí)，雄激素依賴轉(zhuǎn)化前列腺癌患者的AR表達(dá)量高于雄激素依賴患者的AR表達(dá)量，甘道舉等［13］用免疫組化兩步法檢測15例中國人雄激素依賴抵抗性前列腺癌AR表達(dá)發(fā)現(xiàn)，僅1例AR表達(dá)陰性，其余表達(dá)均為強(qiáng)陽性，AR染色的平均光密度值較雄激素依賴性前列腺癌明顯升高，表明雄激素依賴轉(zhuǎn)化前列腺癌有更高的AR基因擴(kuò)增率。我們通過33例病理確診并能接受正規(guī)抗雄激素治療的晚期前列腺癌患者進(jìn)行較長時(shí)間隨訪，在相同隨訪時(shí)間內(nèi)共有18例患者出現(xiàn)雄激素依賴轉(zhuǎn)化，15例患者雄激素依賴無轉(zhuǎn)化。我們對前列腺癌患者在雄激素依賴轉(zhuǎn)化前后的前列腺癌組織標(biāo)本行實(shí)時(shí)RT-PCR方法測定細(xì)胞內(nèi)AR基因的表達(dá)，與同時(shí)期內(nèi)雄激素依賴無轉(zhuǎn)化的前列腺癌患者標(biāo)本作為對照。在雄激素治療前后標(biāo)本利用實(shí)時(shí)RT-PCR方法測定細(xì)胞內(nèi)AR基因的表達(dá)，也有同樣的發(fā)現(xiàn)，雄激素依賴轉(zhuǎn)化組轉(zhuǎn)化后AR基因表達(dá)水平明顯高于轉(zhuǎn)化前[(36.7±1.8)ctvs(28.4±3.4)ct，P＜0.001]，而雄激素依賴無轉(zhuǎn)化組AR基因表達(dá)水平無明顯變化[(29.1±3.2)ctvs(29.5±3.1)ct，P＞0.05]。我們認(rèn)為經(jīng)過內(nèi)分泌治療后前列腺癌細(xì)胞適應(yīng)了低水平的雄激素環(huán)境，AR轉(zhuǎn)錄水平升高，使AR對低濃度雄激素的敏感性增強(qiáng)，前列腺癌細(xì)胞失去對生長的調(diào)控，在極低濃度雄激素環(huán)境下仍能無限增殖，這可能是前列腺癌產(chǎn)生雄激素依賴轉(zhuǎn)化的重要機(jī)制之一。

AR因存在著組織學(xué)標(biāo)本的體內(nèi)生物學(xué)差異，或體內(nèi)與體外細(xì)胞中的生物學(xué)差異，或非親本細(xì)胞株之間的基因差異等因素影響，對于前列腺癌生物學(xué)特性轉(zhuǎn)變機(jī)制的研究，由于缺乏準(zhǔn)確模擬其臨床特點(diǎn)的細(xì)胞和動(dòng)物模型，從而限制了相關(guān)研究的進(jìn)展［14］。

本研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌發(fā)生雄激素轉(zhuǎn)化后細(xì)胞內(nèi)AR基因表達(dá)明顯增加，提示前列腺癌發(fā)生雄激素轉(zhuǎn)化機(jī)制與AR基因擴(kuò)增有關(guān)。AR作為雄激素非依賴前列腺癌治療的靶點(diǎn)，是以后臨床治療及藥物研制的方向。

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