PI3K/Akt信號通路與肝纖維化

黃 成，李 俊，馬陶陶

(安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽合肥 230032)

肝纖維化(hepatic fibrosis，HF)是肝臟對各種慢性刺激進(jìn)行損傷修復(fù)反應(yīng)時，以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)在肝內(nèi)大量沉積的病理過程。關(guān)于HF機制及其防治的研究近年來己成為國內(nèi)外生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究的熱點課題之一。肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)在肝纖維化形成過程中居核心地位，它激活、增殖，并合成、分泌細(xì)胞外基質(zhì)等多種物質(zhì)，使ECM合成與降解失衡，在肝臟內(nèi)過度沉積，肝臟結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致肝纖維化［1］。磷酯酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases，PI3K)家族，是一類特異性地催化磷酯酰肌醇(phosphatidylinositol，PI)3位羥基磷酸化，并產(chǎn)生具有第二信使作用的肌醇脂物質(zhì)的激酶，可以募集和激活下游的靶物質(zhì)而啟動一系列信號聯(lián)級反應(yīng)。PI3K普遍存在于體內(nèi)各類細(xì)胞，在細(xì)胞存活與分化、細(xì)胞生長、運動和凋亡等多種生理和病理過程中起重要作用［2］，參與自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病以及腫瘤等多種疾病的發(fā)生發(fā)展［3－5］。大量文獻(xiàn)表明PI3K信號通路與肝纖維化的形成密切相關(guān)［6］，現(xiàn)就PI3K/Akt信號通路及其在肝纖維化中的作用作一綜述。

1 PI3K/Akt信號通路的組成

1.1 PI3K的組成PI3K是Whitman等［7］發(fā)現(xiàn)的一種與細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的脂類第二信使，與v-src和v-ras等原癌基因的產(chǎn)物相關(guān)。哺乳動物細(xì)胞中PI3K是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110所組成的異二聚體，具有磷脂酰肌醇激酶和絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的雙重活性。依結(jié)構(gòu)和底物的特異性不同，PI3K為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型;能被細(xì)胞表面受體激活的Ⅰ型PI3K研究最多;Ⅰ型PI3K依p110結(jié)合亞基的不同又分為IA和IB兩種亞型;IA型PI3K催化亞基p110包括p110α，p110β，p110δ;調(diào)節(jié)亞基主要有 p85α，p85β，p85γ;IB型PI3K催化亞基主要為 p110γ［8］;調(diào)節(jié)亞基包含:1個SH3區(qū)域、2個富含脯氨酸的區(qū)域、2個被一非編碼區(qū)分開的Src同源結(jié)構(gòu)域(Src homology domain 2，SH2)，該非編碼區(qū)為p85和p110相互作用的區(qū)域，2個SH2結(jié)構(gòu)域可與磷酸化的酪氨酸殘基結(jié)合，引起催化亞基的膜轉(zhuǎn)位和活化，傳導(dǎo)酪氨酸激酶信號。Ⅰ型PI3K在體內(nèi)最常見底物為磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸［PtdIns(4，5)P2，簡稱 PIP2］［9］。

1.2 Akt的組成Akt(v-akt murine thymoma viral oncogene homolog)又稱蛋白激酶B(PKB)，是原癌基因c-akt編碼的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。目前發(fā)現(xiàn)Akt有3種亞型:Akt1和Akt2在人體各組織中普遍表達(dá)，Akt3表達(dá)則有組織特異性［10］。3者受不同的基因編碼調(diào)節(jié)，蛋白結(jié)構(gòu)有將近80%的同源性，由位于氨基端的PH結(jié)構(gòu)域、中間催化域和羧基端的調(diào)節(jié)域結(jié)構(gòu)域組成。PH結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)脂質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用;中間催化域具有催化絲/蘇氨酸殘基磷酸化活性;羧基端的調(diào)節(jié)域含有磷酸化位點Ser473，該位點的磷酸化是Akt完全活化所必需的［11］。

2 PI3K/Akt信號通路的活化

PI3K/Akt通路的激活是一個多步驟的過程，包括兩種方式，一種是與具有磷酸化酪氨酸殘基的生長因子受體或連接蛋白相互作用，引起二聚體構(gòu)象改變而被激活;另一種是通過Ras和p110直接結(jié)合導(dǎo)致PI3K活化［12］。當(dāng)細(xì)胞外的配體與相應(yīng)的受體結(jié)合后，受體被激活發(fā)生同源或異源寡聚化或者RTK(receptor tyrosine kinase，受體酪氨酸激酶)自身磷酸化，為p85調(diào)節(jié)亞單位的SH2結(jié)構(gòu)域提供錨定位點，激活p85;改變p110和p85復(fù)合體的構(gòu)象，解除p85對p110激酶的抑制，活化p110，催化膜表面的 PIP2，生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸［PtdIns(3，4，5)P3，簡稱PIP3］。PIP3作為第二信使與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，使其從胞質(zhì)轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜，定位于PDK1(phosphoinositide dependen tkinase 1，磷酸肌醇依賴性激酶1)和PDK2附近。Akt的構(gòu)象發(fā)生變化，暴露其磷酸化位點，PDK1磷酸化Akt的Thr308，PDK2磷酸化Ser473;活化的Akt脫離質(zhì)膜進(jìn)入胞質(zhì)和胞核，引起信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的級聯(lián)反應(yīng)，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞的生存、增殖、分化、凋亡等重要的生物學(xué)事件［13］。

3 PI3K/Akt信號通路的調(diào)節(jié)

PI3K/Akt信號通路受到很多因素的影響。磷酸酯酶PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)通過使 PI(3，4，5)P3 在3羧基位脫磷酸生成PI(4，5)P2拮抗PI3K的活性。SHIP1/2(SH2 domain containing inositol 5`-phosphatase)基因，通過使PI(3，4，5)P3 在5 位去磷酸化，生成 PI(3，4)P2，減少 Akt的活化［14］。抑癌基因PHLPP1/2(PH domain leucine-rich repeat protein phosphatase)包括PHLPP1和 PHLPP2，可減弱Akt疏水基團(tuán)的磷酸化水平，抑制細(xì)胞周期G1期向S期的轉(zhuǎn)化［15］。最近研究人員利用Akt羧基末端調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域為探針，發(fā)現(xiàn)一種抑制Akt的磷酸化的負(fù)性調(diào)節(jié)因子——羧基末端調(diào)節(jié)蛋白(CTMP)，可阻斷Akt下游信號的傳遞。

4 PI3K/Akt信號通路與肝纖維化關(guān)系

肝纖維化是慢性損傷導(dǎo)致肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)過度沉積，肝星狀細(xì)胞(HSC)是肝纖維化的主要效應(yīng)細(xì)胞。在各種因素作用下，肝細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和星狀細(xì)胞自身可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子與活化產(chǎn)物等，這些因子可以通過各種信號通路調(diào)節(jié)HSC的功能，PI3K/Akt是其中重要的一條通路［16］。

4.1 PI3K/Akt信號通路和肝臟ECM的關(guān)系細(xì)胞外基質(zhì)特別是膠原的過度沉積，是肝纖維化形成的病理基礎(chǔ)。研究表明，PI3K/Akt信號通路在肝臟ECM產(chǎn)生和降解中起到重要作用。Reif等［17］應(yīng)用PDGF刺激HSC發(fā)現(xiàn)，Akt的磷酸化水平、α1(Ⅰ)mRNA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平均升高;其后應(yīng)用 PI3K抑制劑 LY294002或 Akt顯性失活突變體Ad5dnAkt發(fā)現(xiàn)，α1(Ⅰ)mRNA和Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)水平均明顯減少;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因小鼠pCol9GFP-HS4，5分離的HSC，應(yīng)用 LY294002可抑制報告基因的活性，表明PI3K在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)膠原蛋白的表達(dá)。而利用Ad-SMAdn-PI3K轉(zhuǎn)染活化的HSC，通過熒光顯微鏡觀察可發(fā)現(xiàn)阻斷PI3K活性能夠減少α1(Ⅰ)膠原的表達(dá)［18］。上述研究表明PI3K/Akt信號通路活性與膠原的生成具有明顯的相關(guān)性。

肝纖維化的產(chǎn)生是肝臟ECM的合成和降解失衡的過程，與肝臟ECM降解相關(guān)的主要是基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)和金屬蛋白酶組織抑制因子(TIMP)。MMP具有降解膠原等ECM的作用，而TIMP可抑制MMP的作用。PI3K/Akt信號通路與MMP、TIMP的表達(dá)亦有關(guān)系。應(yīng)用黃嘌呤和黃嘌呤氧化酶作用于HSC，可使MMP-2與TIMP-2表達(dá)增高，利用PI3K抑制劑渥曼青霉素(wortmannin)或雷伯霉素(rapamycin，p70S6K抑制劑)則降低兩者的表達(dá)［19］。Li等［20］應(yīng)用leptin刺激HSC，發(fā)現(xiàn)TIMP-1表達(dá)增高與PI3K/Akt的活性有關(guān)。Lechuga等［21］也報道 LY294002能明顯抑制 TGFβ1對MMP-13的mRNA和蛋白誘導(dǎo)作用。這些實驗結(jié)果提示，活化PI3K/Akt在不同的細(xì)胞微環(huán)境中對MMP分泌的調(diào)節(jié)不同，對TIMP的調(diào)節(jié)則主要表現(xiàn)為增加分泌。由此給我們新的啟示:PI3K/Akt信號通路可影響MMP和TIMP的平衡，通過干預(yù)PI3K/Akt信號通路恢復(fù)MMP和TIMP的平衡可成為抗肝纖維化的一個靶點。

4.2PI3K/Akt信號通路與HSC的關(guān)系肝星狀細(xì)胞(HSC)的激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，研究HSC增殖、凋亡的機制對了解肝纖維化的形成具有重要意義。近年來的多項研究表明，PI3K/Akt通路在HSC增殖、凋亡中扮演重要角色。Sancho-Bru等［22］將HSC與Huh7細(xì)胞共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)Huh7細(xì)胞主要通過PI3K/Akt通路的活化促進(jìn)HSC的增值。利用Ad-SMAdnPI3K轉(zhuǎn)染HSC，培養(yǎng)72 h后可發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)量減少;進(jìn)一步研究表明Ad-SMAdnPI3K轉(zhuǎn)染的HSC與對照組比較，細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)明顯降低［18］。而利用高半胱氨酸(0.5 mmol·L－1)處理 HSC，48 h后采用［3H］-thymidine參入法檢測，DNA合成率可提高73%，7 d后檢測細(xì)胞數(shù)提高51%，應(yīng)用渥曼青霉素處理后，則明顯抑制HSC的增值［23］。TRAIL是腫瘤壞死因子(TNF)超家族的成員之一，因能夠選擇性地誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，而對正常組織細(xì)胞幾乎無毒性，受到廣泛的關(guān)注。利用TRAIL處理LX-2人肝星狀細(xì)胞系，可使細(xì)胞凋亡比率明顯增加，同時Akt磷酸化水平亦降低［24］。Panner等［25］在研究多形性惡性膠質(zhì)瘤發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路可通過活化mTOR(Mammalian target of rapamycin，一種與PI3K/Akt通路相關(guān)的蛋白激酶)激活p70S6K(核糖體40S小亞基S6K蛋白激酶，通過磷酸化S6K，增強mRNA的翻譯)，促進(jìn)FLIP(c-FLICE inhibitory protein)的蛋白表達(dá)，F(xiàn)LIP通過抑制caspase-8的活性，而抑制TRAIL引起的細(xì)胞凋亡。我們近期研究亦發(fā)現(xiàn)，肝纖維化形成過程中c-FLIPL表達(dá)明顯增加，通過siRNA干擾抑制c-FLIPL可明顯增加HSC對TRAIL誘導(dǎo)凋亡的敏感性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路調(diào)控c-FLIPL的表達(dá);上述實驗結(jié)果表明PI3K/Akt信號通路在促進(jìn)細(xì)胞增殖的同時，亦通過調(diào)控c-FLIPL抑制細(xì)胞凋亡。應(yīng)用促HSC凋亡的藥物聯(lián)合PI3K/Akt抑制劑，將有效的抑制HSC增殖，促進(jìn)HSC的凋亡，減少ECM的分泌，這給我們治療肝纖維化提供了新的思路。

4.3PI3K/Akt與致纖維化因子在肝纖維化病程中，一系列細(xì)胞因子通過旁分泌和自分泌方式作用于HSC，影響其活化、增殖與凋亡，調(diào)控著肝纖維化的發(fā)生、發(fā)展［26］。

轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth facor beta，TGF-β)是刺激HSC分泌ECM作用最強的細(xì)胞因子之一。TGF-β由Kupffer細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞、肝細(xì)胞和HSC等多種細(xì)胞所分泌，Smad信號蛋白通路是TGF-β經(jīng)典的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［27］。利用 TGF-β1作用于 LY294002預(yù)處理后的人HSC，TGF-β1 依賴性的 ADAM12(融合素-α，參與肌母細(xì)胞融合和肌管形成)表達(dá)減少，p70S6K磷酸化水平亦明顯降低［28］。Neef等［29］，在應(yīng)用 BDL 和 TAA 建立大鼠肝纖維化模型過程中，分別與28 d，42 d后給予大鼠口服雷帕霉素(0.5 mg·kg－1·d－1)14 d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與未用雷帕霉素相比，TAA組大鼠 TGF-β1 mRNA水平降低 50%，BDL組大鼠TGF-β2 mRNA水平亦降低50%。Runyan等［30］在研究TGF-β作用于腎小球系膜細(xì)胞時亦發(fā)現(xiàn)，LY294002或Akt顯性失活突變體可減少TGF-β誘導(dǎo)的α1(Ⅰ)、α2(Ⅰ)膠原的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β誘導(dǎo)的PI3K/Akt活化可磷酸化Smad3的絲氨酸位點，從而增強Smad3的轉(zhuǎn)錄活性，來增強Ⅰ型膠原的表達(dá)。說明PI3K/Akt的活化具有促進(jìn)TGF-β表達(dá)，增強其活性的功能。

血小板源性生長因子(PDGF)是強大的促細(xì)胞分裂劑，是體內(nèi)主要的促纖維化因子，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)4種亞型，且在HSC均有表達(dá)［31］;PDGFβ受體表達(dá)增加是HSC活化的一個標(biāo)志，PDGFβ受體合成與PI3K/Akt通路有關(guān)，應(yīng)用PI3K通路抑制劑渥曼青霉素和LY294002可阻斷PDGFβ受體的表達(dá)［32］;Wang等［33］研究了索拉非尼(靶向抑制 PDGF 受體)抗纖維化作用，發(fā)現(xiàn)索拉非尼可通過抑制Akt、p70S6K磷酸化，抑制HSC的增殖，降低膠原的合成。Chen等［34］利用絞股藍(lán)總苷處理PDGF誘導(dǎo)的HSC，研究發(fā)現(xiàn)，絞股藍(lán)總甙通過抑制PDGF-PI3K/Akt-p70 S6K信號途徑抑制PDGF誘導(dǎo)的HSC增殖活化。以上實驗結(jié)果表明，PI3K/Akt信號通路在PDGF受體的表達(dá)，信號的傳導(dǎo)中具有重要作用。

胰島素樣生長因子(insulin-like growth factors，IGFs)是一類重要的促細(xì)胞活化、分裂的生長因子，在促進(jìn)HSC增殖、分化等方面起了重要的作用。研究證實LY294002和雷帕霉素抑制IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的鼠HSC中DNA合成;利用絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)抑制劑PD98059對IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的DNA合成抑制作用較弱;說明PI3K信號傳導(dǎo)途徑，在IGF-Ⅰ誘導(dǎo)HSC的DNA合成中起著重要作用［35］。Gentilini等［36］利用渥曼青霉素和 LY294002抑制IGF-Ⅰ誘導(dǎo)的 HSC分化，影響其 DNA合成，揭示了IGF-Ⅰ能通過PI3K信號傳導(dǎo)途徑，影響HSC遷移及促有絲分裂，激活HSC的增殖。

瘦素(leptin)在肝纖維化形成過程中也發(fā)揮了重要的作用［37］。Aleffi等［38］應(yīng)用 leptin 處理人 HSC，結(jié)果表明 MCP-1(monocyte chemoattractant protein 1)，VEGF(vascular endothelial growth factor)，Ang-1(angiopoietin-1)等促炎癥反應(yīng)和促纖維化因子表達(dá)明顯增高，并增強PI3K/Akt通路的活性。我們前期應(yīng)用 leptin(75 μg·L－1)處理原代培養(yǎng)的大鼠HSC，Western blot和EMSA分析顯示Ⅰ型膠原明顯增高，采用［3H］-thymidine參入法研究了leptin對HSC增值效應(yīng)，結(jié)果顯示增值率達(dá)正常值的3倍，并明顯促進(jìn)Cyclin D1表達(dá);而應(yīng)用LY294002或A771726(來福米特活性代謝物)預(yù)培養(yǎng)后HSC增值效應(yīng)，Cyclin D1及Ⅰ型膠原的表達(dá)明顯受到抑制［39］。PI3K/Akt對促肝纖維化因子的調(diào)控作用，顯示了PI3K/Akt通路在肝纖維化形成中的重要地位。

細(xì)胞信號通路是個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，PI3K/Akt信號通路與其他信號通路之間存在密切的聯(lián)系，對肝纖維化的形成也具有重要作用。如IGF-1和PDGF可同時增加HSC中PI3K和ERK通路的活性，而PI3K還參與ERK通路的激活。信號通路的協(xié)同作用對肝纖維化進(jìn)程中維持HSC的活化狀態(tài)具有重要作用。有報道［32］，在人HSC的培養(yǎng)中，應(yīng)用PI3K的抑制劑可使Ras/ERK通路的活性下降40% ～50%，表明PI3K參與Ras/ERK通路的活化。

5 展望

肝纖維化的形成是一個復(fù)雜的過程，涉及多條信號通路、多種細(xì)胞和細(xì)胞因子。PI3K/Akt信號通路從多個方面參與肝纖維化的形成。細(xì)胞因子間在體內(nèi)如何協(xié)調(diào)，各條通路間的相互作用及PI3K/Akt通路所起的作用還有待進(jìn)一步研究;不同因素造成的肝纖維化模型中及肝纖維化形成的不同階段，PI3K/Akt通路所起作用的差別也有待進(jìn)一步明確。抗肝纖維化藥物的研發(fā)是目前的熱點，PI3K/Akt通路是由多種物質(zhì)序貫而成，許多物質(zhì)與其他通路間又存在交叉聯(lián)系，因此在研究藥物對其作用時，既要把握重點，又要有整體觀念。

總之，PI3K/Akt信號通路在肝纖維化發(fā)病機制中發(fā)揮著重要作用，隨著對它認(rèn)識的逐步深入，對于闡明肝纖維化的發(fā)病機制，尋找治療肝纖維化的方法有著積極的意義。

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