納米技術在阿爾茨海默病基因診斷的研究進展

周竹青 易 黎 韓金玲 沈惠敏 (北京大學深圳醫院,廣東 深圳 58036)

阿爾茨海默病(AD)難以早期確診,尚缺乏靈敏、快速、準確的活體診斷技術,確診率較低。因此,尋求早期診斷AD,特別是應用納米技術檢測AD易感基因,已經成為了神經變性疾病領域的研究新熱點和難點。現就AD的基因研究現狀以及納米技術在早期診斷AD的應用與進展綜述于下。

1 AD的基因研究現狀

AD是老年人中常見的中樞神經系統變性疾病〔1〕,特征性病理變化為大腦皮層萎縮,并伴有 β-淀粉樣蛋白(Aβ)沉積,神經原纖維纏結,大量記憶性神經元數目減少以及老年斑的形成。臨床上以50～60歲以后進行性加重的智能障礙、記憶力減退、精神運動異常為主要癥狀〔2〕。截止2005年,全球該病患者已有兩千多萬,每年新發病例460多萬(每7秒新增1例患者)〔3〕。我國65歲以上人群遭受該病困擾的人數估算已超過600多萬〔4〕。AD是繼癌癥和心臟病后第三位花費最大的疾病,給患者家庭和社會均帶來了極大的負擔〔5,6〕。AD可劃分為家族性和散發性,目前的治療尚無根本性進展,多以早期預防和準確診斷為主。而AD的確診,除了在患者病逝后通過大腦的病理檢查老年斑和神經原纖維纏結這些指標進行疾病的回顧性診斷外,臨床上主要依靠神經科醫師以臨床病史采集(NINCDS-ADRDA診斷標準〔7〕)和神經心理量表測定(MMSE、ADAS-Cog〔8〕等),影像學檢查等為診斷手段,尚缺乏靈敏、快速、準確的活體診斷技術,因而其診斷率目前僅有 10% ～15%〔9〕。在AD眾多的可能病因中,如遺傳、環境、代謝、病毒感染等多種因素,遺傳因素是其主要原因之一。目前已知與AD相關的基因至少有50個,主要分布在染色體的1、6、12、14、17、19和21號,這些基因的變異頻率AD患者較正常人要高3～5倍,其中有些基因與家族性AD相關,有些與散發性AD相關〔10〕。下面就AD相關的主要基因及其功能蛋白質的研究進展展開討論。

1.1 載脂蛋白E(ApoE)基因 1973年,Shore等首次在正常人極低密度脂蛋白中發現ApoE。ApoE基因位于19q1312,全長3.7 kb,有 4個外顯子,3個等位基因(ε 2、ε 3和 ε 4),分別編碼產生 E2、E3、E4三種蛋白。3個等位基因中,ε 4是目前公認的AD危險因素,與散發性AD關系密切。ε 4與40%～50%的早發性AD及80%的遲發性AD相關,并與AD發病率呈劑量-依賴性關系,可使AD發病年齡提前;而 ε 2和 ε 3可使 AD發病率降低,發病年齡延遲,是一種保護性因素。其機制可能是ε 4等位基因與淀粉樣前體蛋白(APP)基因間相互作用,影響其水解位點,增加 Aβ沉積,導致早老素(SP)發生和膽堿不足。ApoE3和ApoE4與Tau蛋白間存在相互作用,ApoE3可與Tau蛋白形成耐受十二磺基磺酸鈉的復合物,ApoE4則不能。這提示ApoE3可結合并調節Tau蛋白的磷酸化,促進微管蛋白裝配;而ApoE4的作用正好相反。遲發性 AD伴ApoEε 4等位基因患者的腦組織中,其Aβ沉積高于遲發性AD未伴 ApoEε 4等位基因患者;提示ApoEε 4等位基因是個體發生AD的危險因素,在AD發生發展中起重要作用。另外,Persson〔11〕等發現在AD發病以前,ApoEε 4的存在可影響顯微鏡下胼胝體白質的完整性。Trittmatter〔12〕研究證實,在 AD患者的腦脊液中發現ApoE與Aβ可高度結合,因此推測ApoE在患者SP的形成中有分子伴娘作用,參與調節淀粉樣蛋白的形成。由于 AD的ApoE4升高具有較高的特異性,ε 4等位基因與AD發病有關,是散發性AD最重要的危險因子,因此建議將其列入AD的基因診斷標志。

1.2 淀粉樣前體蛋白(APP)基因 APP基因位于21號染色體,長約300 kb,由19個外顯子組成,與 AD緊密連鎖,是最早發現與AD相關的突變基因,為常染色體顯性遺傳,與家族性早發型 AD有著密切關系。正常生理條件下,多數 APP由 α-分泌酶裂解成可溶性 β-APP釋放到神經元外,β-APP被 γ-分泌酶裂解,極少部分 β-APP在胞質經溶酶體內的 β-和 γ-分泌酶作用裂解為 Aβ〔13,14〕。當APP基因發生突變時,突變的APP產生新的酶切位點,易被 β-分泌酶水解,并在 γ-分泌酶作用下形成游離 Aβ;Aβ越長,毒性作用越強,這是因為它能聚集到更多的Aβ,裝配成不溶性的共聚體沉淀,這是Aβ神經毒性的結構基礎。聚集的Aβ形成不可逆沉淀,最終導致 SP形成,從而引起AD。AD的發生與APP基因的過度表達以及經 β-和 γ-分泌酶產生的Aβ在腦內堆積和沉淀有關。Aβ是各種因素誘發AD的共同通路,是 AD形成和發展的關鍵因素。Hardy〔15〕等提出的淀粉樣蛋白級聯假說認為,Aβ在大腦皮層堆積是AD病理發生的早期關鍵事件,最終導致AD其他的病理變化。

1.3 Tau蛋白基因 Tau蛋白基因位于17號染色體,在種系間高度保守,Tau蛋白是其表達產物,主要分布于人類大腦額葉、顳葉、海馬及內嗅區等部位,是體內含量最高的微管相關蛋白。目前,在成人腦組織中發現6種Tau蛋白異構體,其相對分子質量為48 000～67 000,有352～441個氨基酸。AD患者腦中Tau蛋白發生異常修飾,過度磷酸化,隨之聚集成雙螺旋纖維絲形式(PHFs),喪失了促進微管組裝的生物活性,故導致細胞骨架結構異常和神經細胞死亡〔16〕。AD患者部分過度磷酸化Tau蛋白是可溶的,另一部分沉積在PHFs中為不可溶的,稱為PHF-Tau。PHF-Tau沉積于腦中可致神經元變性。

1.4 早老素1(PS-1)和早老素2(PS-2)基因 PS基因是目前發現的另一個與AD發病密切相關的基因。PS占家族性AD致病基因的30%～50%,占早發型 AD致病基因的70% ～80%。PS-1和 PS-2基因分別定位于14和1號染色體,即14q24.3和1q41.2,長約75和90 kb。PS-1和PS-2屬進化保守基因家族成員,其疏水外型是具有大量跨膜區域的整合膜蛋白,基因產物位于內質網和高爾基體,提示PS可能在分泌通路上調節蛋白質的轉運和合成。PS-1或PS-2突變基因患者Aβ42升高可能由于PS-1或PS-2蛋白質功能異常所致。迄今已發現至少37種PS-1基因突變與早發性AD有關〔17〕。一定條件下,PS-1基因突變細胞選擇性地導致纖維原性較強的、易聚集的Aβ42產生過多,從而導致AD發生。PS-1基因缺陷可通過抑制β-APP的 γ-分泌酶發生裂解,減少 β-APP形成。另外,PS-1基因突變還可引起Tau蛋白等細胞骨架蛋白之間的相互作用異常,破壞離子通道的微結構,影響細胞內外離子交換,引起AD病理改變。突變的PS-2基因表達產物可通過對C末端肽水解酶的影響而作用于APP的水解過程,使聚集性Aβ產生增多而發生沉積,形成SP,協助Aβ升高細胞內鈣,加重氧自由基產生,促進線粒體膜電位下降,從而引起細胞凋亡。梁平〔18〕等研究結果表明突變型PS-1(M146L)導致 Aβ1-42的分泌增加,提示PS-1有可能作為預期的 γ-分泌酶參與APP分解生成 Aβ的過程。也有人認為PS是一種 γ-分泌酶的協同因子或 γ-分泌酶通路中的協調物〔19〕。 De Strooper〔20〕則提出,PS-1 與 PS-2 可能是γ-分泌酶催化亞基。因此 PS對 APP代謝過程是如何作用的尚有待研究。以上是對AD主要相關基因Apo E、APP、PS-1和PS-2等位基因的研究現狀的總結,那么如何早期檢測這些AD相關基因,尤其應用高新技術靈敏高效地檢測AD致病基因？

2 納米技術在早期檢測AD患者基因的應用與前景

檢測基因的方法,目前診斷醫學主要有放射性核素和熒光分析法。其中熒光分析法因其操作程序簡便,觀測安全而較受重視。但是,傳統的熒光染料具有一定的缺陷:易光漂白和光解,故檢測的特異性較低;觀測時間極短。而放射性核素的檢測方法雖有高靈敏度的優越性,但因其對環境的高污染危害而漸趨淘汰。目前研究的納米技術既有靈敏度和特異性高的優點,又彌補了上述方法的缺陷,可用于檢測AD的易感基因,詳述如下。

2.1 應用納米晶體標記探針檢測散發性AD的ApoEε 4基因

目前已陸續發現多種基因如 APP、PS1、PS2、ApoEε 4、A2M、LRP1、TNF、ACE、MTHFR 和 mtDNA 等與 AD 相關〔21〕。近年來,發病率更高的散發性AD受到較多的關注。ApoEε 4等位基因是ApoE主要基因型之一,其第4號外顯子上有2個位點發生變異。ApoEε 4等位基因與AD發病有關,是散發性 AD最重要的危險因子。確定ApoE基因型有助于臨床篩查和早期診斷大部分相關患者,篩查需要進行干預治療的人群。

楊華靜等〔22〕應用熒光半導體納米晶體與ApoEε 4等位基因特異性寡核苷酸反應合成探針,來檢測AD陽性標本和陰性標本的ApoE的基因型,得出新型熒光探針檢測結果與標本基因型一致的結論,并大膽推測熒光半導體納米晶體標記探針將替代傳統方法,有望成為一種有效可靠的早期篩選AD的方法。這種新型材料熒光半導體納米晶體,標記寡核苷酸探針,用于檢測 ApoEε 4等位基因,具有靈敏度和特異性高的優點,熒光檢測時間窗長達數天,其無毒無害的特點相對于目前臨床上應用的放射性核素,具有更大的優越性〔23,24〕。

2.2 應用納米磁珠技術早期檢測家族性AD患者APP基因研究表明〔15,25〕,APP基因突變可能是導致具有遺傳異質性的家族性AD(FAD)的重要病因之一。FAD患者的21號染色體上APP基因第670和671位氨基酸密碼子存在突變,揭示了APP基因突變可能是導致FAD患者腦內Aβ過量沉積的關鍵原因。Aβ是構成FAD特征性的病理改變之老年斑的核心成分,同時也被認為是FAD最重要的致病物質之一。因此準確檢測APP基因型有助于早期篩查FAD,對該疾病的防治有著重大的社會意義。納米顆粒(Nano particles)被譽為21世紀的新材料,其概念在20世紀中葉被科學界提出后得到了廣泛重視和深入的發展。納米顆粒尺度一般為1～100 nm,介于原子簇與一般微粒子之間。其所具有的量子效應,表面效應與協同效應使其展現出許多特有的性質,如比表面積大,表面活性中心多,毒性低且不易受體內和細胞內各種降解的影響。隨著納米技術的迅速發展,納米顆粒逐漸被應用到細胞生物學和分子生物學研究領域。尤其是納米磁珠(MNP)在醫學病原微生物檢測中的廣泛應用,充分顯示了其良好的醫學應用前景。

我們擬應用納米磁珠與APP等位基因相對應的特異性寡核苷酸互補形成納米芯片探針,結合該目標單鏈寡核苷酸,特異、高效、快速富集受檢者口腔拭子標本中APP基因的痕量DNA(可低于105,稱低拷貝模板),結合后續PCR等檢測技術,為早期全面準確基因篩查FAD患者,提供一種新型高靈敏度,簡易快速,特異性的基因診斷技術。納米芯片探針一旦研發成功在大規模人群中篩查推廣使用,可具有重大社會意義。

3 總結與展望

隨著對AD相關基因及其蛋白質研究的深入,以及越來越多與AD相關新基因及其功能蛋白質的不斷發現,已知的與AD相關基因新的突變位點和所表達的蛋白功能也會越來越清晰。隨著各種基因和蛋白質研究技術的不斷發展,將會在基因和蛋白水平上探討AD的發病機制并找到一條早期診斷AD的途徑,進而采取有效的治療措施。

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