植物MicroRNA研究進展及其在植物與病原菌互作中的作用

耿銳梅，楊宏偉，曹長代，馮全福，陳志強，羅成剛

(1.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所 煙草遺傳改良與生物技術重點開放實驗室，山東 青島 266101;2.山東日照煙草有限公司，山東 日照 276500)

MicroRNA(miRNA)是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90個堿基大小的單鏈RNA前體經(jīng)Dicer酶加工后生成的一種大小約21～23個堿基的單鏈小分子RNA，不同于siRNA(雙鏈)，但和 siRNA密切相關［1］。1993年 Lee等在線蟲體內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)miRNA，隨后多個研究小組在人類、果蠅、植物等多種生物物種中鑒別出數(shù)百個 miRNA［2］，2002年在擬南芥(Arabidopsis thaliana)上鑒定了第1個植物miRNA。到目前為止，已經(jīng)有320種植物的miRNA家族、多達上千條植物miRNA在miRBase序列數(shù)據(jù)庫中登錄，然而超過半數(shù)miRNA來自擬南芥、楊樹(Populus)和水稻(Oriza sativa)。另外，通過各種計算機軟件或其他計算工具以及分子生物學手段已經(jīng)成功地預測和鑒定了大豆(Glycine max)、 玉 米(Zeamays)、 番 茄(Solanum lycopersicum)、棉花(Gossypium herbaceum)、柑橘(Citrus reticulata Blanco)、葡萄(Vitis vinifera)等多種植物 中已知 的 大多數(shù) miRNA［3－4］。據(jù) 推 測miRNA在高級真核生物體內(nèi)對基因表達的調(diào)控作用可能和轉(zhuǎn)錄因子一樣重要。miRNA可能代表在一個新發(fā)現(xiàn)的層次上的基因表達調(diào)控方式［5］。

文章對植物miRNA的功能、分子進化、調(diào)控機制以及在植物與病原菌互作中的作用進行綜述，旨在闡釋植物miRNA在植物與病原菌互作與進化中的重要作用，為抗病性機制研究提供理論基礎，從而為抗病性育種研究提供一定的研究線索與基礎。

1 植物MicroRNA的生物合成及分子進化

miRNA基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下轉(zhuǎn)錄得到 miRNA前體(pri-miRNA)，由 HASTY(HST)蛋白負責轉(zhuǎn)運至核外，再經(jīng)類Dicer的DCL(Dicer-likeprotein)酶加工剪切為成熟miRNA分子。成熟的miRNA來源于發(fā)夾結(jié)構(gòu)的任意端臂，大多數(shù)miRNA位置上起源于5'臂，可能是由于 5'臂動力學不穩(wěn)定性引起［6－8］。

最初認為，miRNA在所有植物物種間都是保守的，但隨后發(fā)現(xiàn)，擬南芥的一些miRNA在水稻中并不存在。Allen等提出了植物miRNA進化模型，把miRNA分為“古老的”和“現(xiàn)代的”2類:“古老的”miRNA在植物分化為不同類群之前就已進化完成，這類miRNA是保守的;而“現(xiàn)代的”miRNA則是在現(xiàn)有植物種群都出現(xiàn)后才開始進化，是非保守的［9］。對于miRNA基因簇而言，它們在不同物種之間除了序列的保守性，還涉及比如基因排列的共線性(Synteny)、重復拷貝的數(shù)量等一些進化問題。植物基因組中的這2種重復機制也是miRNA基因簇和基因家族進化的主要驅(qū)動力。由此，miRNA基因簇的形成不是隨機性的，而是在自然選擇過程中逐漸積累并得到固定的結(jié)果［10－12］。

2 植物MicroRNA的功能調(diào)控與作用機制

近年來的研究揭示了miRNA生物學功能的多樣性與重要性［13］。最為重要的功能是作為基因表達的負調(diào)控因子，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)靶基因的表達，調(diào)控生物體的正常發(fā)育。miRNA介導的轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控是生物體內(nèi)除了siRNA(small interference RNA)引起的RNA沉默之外的另一條小RNA(small RNA，sRNA)調(diào)控路徑。miRNA參與調(diào)控植物的生長發(fā)育，例如miR396在葉子形態(tài)構(gòu)建中調(diào)控細胞的分裂和分化［14］，在調(diào)控開花時間的miRNA家族成員中:miR156主要調(diào)控植物生長周期轉(zhuǎn)變;miR172通過調(diào)控AP2類基因，控制開花時間和花器官的形成［15］;miR159/miR319的過量表達均會引起一些花發(fā)育障礙如花期延遲［16］。miRNA在多種非生物與生物脅迫響應中發(fā)揮重要作用:例如miR398是第1個被報道的受氧化脅迫負調(diào)控的miRNA，它通過負調(diào)控其靶基因 Cu/Zn過氧化物歧化酶(Cu/Zn-superoxide dismutase，CSD)的表達，在多種逆境脅迫響應中扮演重要角色，如調(diào)節(jié)銅代謝平衡，應答重金屬、蔗糖、臭氧等非生物脅迫，以及參與應答生物脅迫等［17－18］。例如，miR393，miR159和miR164的表達就分別受到脫落酸、赤霉酸和生長素的調(diào)控［19］。另外，由生物或非生物導致的植物葉片卷曲與miR166相關［20］。據(jù)推測miRNA在植物對不同N素條件的適應中有重要作用［21］。除了在轉(zhuǎn)錄后水平和翻譯水平上起作用外，miRNA還參與基因的甲基化和異源染色體形成繼而沉默目的基因。miRNA的存在，對生物正常發(fā)育的生理過程起著極為重要的調(diào)控作用［22］。

miRNA的功能及作用機制方面的研究是當前生命科學研究的前沿熱點之一，miRNA主要機制是抑制靶基因的翻譯表達，并通過mRNA3'端脫腺苷酸化導致整個 mRNA的降解［6］。對 miRNA機制的研究，研究人員陸續(xù)提出了翻譯起始抑制、翻譯起始后抑制、mRNA降解、P小體(Processing Body)，SG(Stress Granules)顆粒扣押靶 mRNA等假說模型，從而闡述miRNA如何抑制其靶基因的表達。最近還有文獻報道了一些全新的miRNA作用方式，如去抑制和 miRNA激活作用等。Sandberg他們發(fā)現(xiàn)，一些在增殖細胞中表達的mRNA 3'UTR保守性地縮短，導致miRNA的靶位點減少，從而產(chǎn)生了一種避免miRNA的負調(diào)控作用的一種逃避miRNA抑制的新方式［23］。

3 植物MicroRNA在植物與病原菌互作中的作用

miRNA不僅參與了植物器官的形態(tài)建成，還參與調(diào)控植物的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)，對植物正常生長發(fā)育起著極其重要的作用。miRNA介導的基因表達調(diào)控其獨特性還在于其靶基因的多樣性及其調(diào)控的反饋控制機制，如近來在植物中一個有趣的發(fā)現(xiàn)是2個在 miRNA途徑上起重要作用的基因 DCL1和AGO1，各自受到 miR162和miR168的負調(diào)控。不僅如此，miRNA還在植物的抗病反應中發(fā)揮著非常重要和特殊的作用［22，24］。

越來越多的研究表明，miRNA是植物防御反應和免疫應答元件的組成部分，植物通過重組和微調(diào)miRNA的基因表達來應對各種植物病原菌的誘導或是抑制作用。這種逆境誘導的基因沉默是通過miRNA的分裂/降解、或者是翻譯阻遏作用、或者是DNA甲基化或染色質(zhì)的改變來實現(xiàn)。在植物與病原菌互作中，病毒和細菌形成基因沉默抑制子(VSRs和BSRs)來抑制寄主植物的 RNAi機制及抗性。與此同時，為了達到與病原菌的協(xié)同進化目的，寄主植物產(chǎn)生能識別基因沉默抑制子、誘導抗病性反應的R蛋白。病毒編碼的沉默抑制子與宿主植物miRNA/siRNA介導的沉默途徑之間的相互作用，以及來源于病毒的小RNA參與植物的抗病反應等，這些新的發(fā)現(xiàn)極大地擴展了人們對植物與病原菌之間相互作用機制的認識［25］。

高新生物技術如核酸高通量測序技術、深度測序技術與miRNA基因合成測序、基因芯片技術、生物信息學中miRNA基因及靶基因預測方法、基因發(fā)現(xiàn)和功能驗證方法、表達序列標簽分析等分子實驗手段相結(jié)合，使得越來越多的新的 miRNA、候選miRNA基因以及非保守miRNA相繼被發(fā)現(xiàn)［23，26-27］。期望新的 miRNA 及靶基因的發(fā)現(xiàn)有助于發(fā)現(xiàn)植物抗病信號傳導途徑中的新元件，從而有助于更深入地理解植物免疫機制。期望越來越多的植物病原菌基因沉默抑制子的發(fā)現(xiàn)，有助于提高對植物病原菌與寄主互作和共進化的理解，進而為植物抗病性育種提供研究線索和理論基礎［25］。

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