弓形蟲單基因和復(fù)合基因疫苗的研究進展＊

劉秀華，李英豪，苑文英，藏愛民，田因詩，余瑞欣，周雅靜

2.保定市婦幼保健院

弓形蟲（Toxoplasmagondii）為專性細胞內(nèi)寄生原蟲，全球分布，能引起人獸共患寄生蟲病，全世界的感染率為34%，大多數(shù)為隱性感染，孕婦感染常引起流產(chǎn)、畸胎、死胎，對于腫瘤患者或AIDS病人等免疫功能受損者，弓形蟲是引起死亡的主要原因之一。此外，弓形蟲病也給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成嚴重的經(jīng)濟損失。迄今尚無治療弓形蟲病的特效藥，因此研制安全有效的疫苗極為迫切。由于弓形蟲生活史較復(fù)雜，抗原成分具有發(fā)育階段的特異性或差異性，因此發(fā)展多種抗原組合、針對不同生活史發(fā)育階段的復(fù)合多價疫苗是研究弓形蟲疫苗過程中的一個發(fā)展方向與共識。具有免疫保護性抗原基因的獲得是基因疫苗研制的基礎(chǔ)工作。已發(fā)現(xiàn)的具有免疫保護性抗原基因，主要集中在（1）弓形蟲表面抗原（SAG）基因；（2）致密顆粒（GRA）基因（3）i蟲體棒狀體蛋白（ROP）基因；（4）微線體蛋白（MIC）基因等候選分子上。

1 表面抗原

1.1 SAG1 作為弓形蟲速殖子表面的主要抗原之一，是迄今應(yīng)用最多的弓形蟲疫苗候選抗原。SAG1蛋白分布于弓形蟲速殖子表膜、速殖子內(nèi)以及納蟲泡的管狀結(jié)構(gòu)中，約占弓形蟲體總蛋白的3%～5%，卻可抑制患者血清中抗體活性的50%，說明SAG1含量雖微，卻是速殖子的主要抗原成份，是誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的主要靶抗原。能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生IgG，Ig M，IgE，Ig A及sIg A，抗SAG1抗體在體外有殺蟲、體內(nèi)有保護作用，并可誘導(dǎo)產(chǎn)生一些細胞因子，如γ－干擾素和細胞毒性淋巴因子，其抗原特異性的CD＋8T細胞能直接殺傷細胞外弓形蟲，對弓形蟲感染的腹腔巨噬細胞亦具有細胞毒性。

1.2 SAG2可使弓形蟲固定于有核細胞的表面，并輔助弓形蟲進入有核細胞，介導(dǎo)弓形蟲速殖子的入侵過程。抗SAG2蛋白抗體也可以阻斷弓形蟲的再定位，還有可能在弓形蟲速殖子向緩殖子轉(zhuǎn)化過程中起作用。SAG2也具有一定的免疫誘導(dǎo)作用，有高世同等［1］研究表明，用編碼SAG2的基因構(gòu)建真核表達質(zhì)粒PBK/SAG2，免疫接種BALB/c小鼠，5周后，取鼠脾細胞作Con A刺激淋轉(zhuǎn)實驗及T細胞亞群測定，結(jié)果CD＋8T細胞明顯增多，顯示SAG2蛋白可刺激機體的細胞免疫應(yīng)答。

1.3 SAG3最長編碼有385個氨基酸殘基，它含有一個疏水的NH2末端及一個GPI錨定位點，它在速殖子、緩殖子及子孢子等多個時期均有表達。最新研究表明SAG3的主要功能是參與蟲體的增殖，但在弓形蟲入侵和增殖的過程中，SAG3究竟起了什么作用，目前并不清楚［1］。

1.4 SAG4由516個核苷酸編碼的大小為172個氨基酸的表面蛋白組成，分子量為18 k D，N端疏水區(qū)為27個氨基酸的信號肽，C末端疏水區(qū)為GPI錨定信號。

2 棒狀體蛋白

2.1 ROP1在侵入宿主細胞的早期影響宿主細胞的通透性。ROP1基因具高度保守性，體外擴增出的弓形蟲RH、ZS1、ZS2及GT14蟲株的ROP1的基因片段，大小為756 bp，蟲株間未見明顯差異。

2.2 ROP2主要協(xié)助蟲體入侵宿主細胞，在弓形蟲生活史的速殖子期、緩殖子期和子抱子期中均有表達，具有高度的保守性和免疫原性。Saavedral等研究ROP2抗原中被T細胞識別表位時發(fā)現(xiàn)，弓形蟲ROP2抗原包含有被多數(shù)免疫個體所識別的T細胞表位（197－216、393－410、501－524）；表位識別試驗結(jié)果顯示，多肽197－216能被45%弓形蟲患者的外周血單核細胞所識別，多肽501－524能被36%患者的外周血單核細胞所識別，多肽393－410的識別率為9%，且三者都不能被弓形蟲病陰性健康者所識別，說明它有作為疫苗候選因子的巨大潛力。在vercammen M［3］等的研究中，含ROP2的重組質(zhì)粒可刺激小鼠產(chǎn)生部分保護效果，且可使C3H系小鼠抵抗致死性經(jīng)口弓形蟲感染。

3 致密顆粒蛋白

GRA在宿主與寄生蟲的相互作用中起重要作用，對人體和動物具有較強的免疫反應(yīng)性和免疫原性，在弓形蟲病診斷和免疫預(yù)防的研究中受到廣泛關(guān)注。

3.1 GRA2分子量為28.5 k Da，在編碼區(qū)有一個內(nèi)含子，內(nèi)部存在螺旋結(jié)構(gòu)，為兩個不同性質(zhì)的α－螺旋。其抗原性很強，用純化的GRA2免疫小鼠，抗攻擊感染的小鼠存活率為75%。目前研究表明GRA2在急慢性弓形蟲感染血清中普遍存在，至少存在3個B細胞表位和1個T細胞表位，可誘發(fā)機體產(chǎn)生IgG，Ig M，Ig A多種抗體，激活GRA2特異性的CD＋4T細胞，誘導(dǎo)機體的保護性免疫。

3.2 GRA 3基因為單拷貝，其cDNA在N一末端編碼2個蛋氨酸，相鄰有1個開放閱讀框。富含脯氨酸，不含內(nèi)含子，在體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平很高，可用于弓形蟲病的診斷和作為疫苗的候選分子。薛書江等［4］成功建立了真核表達質(zhì)粒p VAX－GRA3，并采用陽離子脂質(zhì)體將p VAX－GRA3質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)入Hela細胞。RT－PCR檢測結(jié)果顯示，GRA3基因在Hela細胞中得到有效轉(zhuǎn)錄，表明陽離子脂質(zhì)體成功地將p VAX－GRA3轉(zhuǎn)入靶細胞。而GRA 3基因的表達蛋白是否具有較好的反應(yīng)原性和免疫原性，還需進一步探討。

3.3 GRA7 Velmurugan等［5］在大腸埃希菌中重組表達了弓形蟲GRA7，免疫印跡和酶聯(lián)免疫吸附測定證明重組GRA7具有良好的反應(yīng)原性，可用于弓形蟲急性感染的診斷。Sadeghiani等［6］重組表達了弓形蟲GRA7，免疫印跡分析表明重組GRA7能與弓形蟲急性感染人血清反應(yīng)，與慢性感染血清反應(yīng)弱，陰性血清無反應(yīng)，提示重組GRA7可用于研制弓形蟲感染的診斷試劑盒。皮內(nèi)免疫GRA1和GRA7 DNA疫苗混合物產(chǎn)生高滴度的抗GRA1、GRA7及弓形蟲裂解產(chǎn)物的抗體，攻擊感染后檢測到淋巴細胞增殖和IFN－γ生成，提示DNA疫苗可有效抵抗弓形蟲感染［7］。這些研究已證明，弓形蟲GRA7是弓形蟲病的一種重要診斷抗原和疫苗候選抗原。

4 微線體蛋白

目前已知的微線體蛋白有15種以上，包括MIC1－MIC12、AMA1、Tg－SUB1、Tg－SUB2等，大多含有類似真核細胞黏附分子的保守結(jié)構(gòu)域，如血小板結(jié)合蛋白樣結(jié)構(gòu)域、整合素A樣結(jié)構(gòu)域、表皮生長因子樣結(jié)構(gòu)域、幾丁質(zhì)連接樣結(jié)構(gòu)域和蘋果樣基序等。

4.1 MIC3是一種大小為90 k D蛋白，參與蟲體與宿主細胞間的黏附過程，且在弓形蟲速殖子、緩殖子和子孢子3個感染階段都有表達。MIC3在早期能夠誘導(dǎo)小鼠和人分泌高效價的IgG抗體以及IFN－γ、IL－2、IL－4和IL－10等細胞因子，使機體產(chǎn)生高強度的體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，作為疫苗候選分子具有巨大的潛力。

4.2 MIC4在弓形蟲生活史的所有感染階段中均有表達，基因全長1 743bp，無內(nèi)含子，單拷貝。與宿主細胞相連，其C端的App6結(jié)構(gòu)具有黏附功能。Beghetto［8］等構(gòu)建了含MIC4等5種微線體基因片斷的質(zhì)粒，經(jīng)研究表明此質(zhì)粒產(chǎn)生了很好的免疫保護性，預(yù)示著MIC4作為一種疫苗組分的可行性。同樣，在Lourenco［9］等的研究中，MIC4亦觸發(fā)了良好的免疫反應(yīng)，促使機體多種細胞因子如IL－2，IL－12，IFN－γ，IL－10等水平上升。

4.3 MIC8是一個單基因拷貝序列，無內(nèi)含子，它所編碼的蛋白是MIC3蛋白的護送蛋白，在速殖子和緩殖子期都有表達，可幫助MIC3蛋白到達微線體并分泌出胞。Meissner等用EGF樣結(jié)構(gòu)域序列搜索剛地弓形蟲表達序列標數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)MIC8含有一個幾丁質(zhì)樣區(qū)和十個EGF樣結(jié)構(gòu)域。EGF結(jié)構(gòu)域是表皮生長因子序列內(nèi)部的功能域，而許多蛋白也有EGF樣結(jié)構(gòu)域，它們與EGF的氨基酸序列和受體識別能力相似并執(zhí)行類似的功能。EGF受體是啟動酪氨酸激酶信號傳導(dǎo)通路的重要分子，在很多細胞都有表達。EGF與受體結(jié)合后可激活受體蛋白酪氨酸激酶，進而激活一系列反應(yīng)，最終導(dǎo)致合成RNA，蛋白質(zhì)和脂類，復(fù)制DNA，細胞分裂。EGF/EGFR可能是低免疫人群對弓形蟲易感的重要分子基礎(chǔ)之一。MIC8作為微線體蛋白中EGF樣結(jié)構(gòu)域含量較高者，很有可能在弓形蟲粘附宿主細胞的過程中起著重要的作用。最新研究表明，當(dāng)MIC8不存在的時候，蟲體不能與宿主細胞形成接觸融合區(qū)域，使得侵入宿主細胞過程受阻，這種由MIC8參與形成的細胞融合區(qū)域非常重要，不可被其他的微線體蛋白來替代，從而表明MIC8是一種新穎的，功能獨特的蛋白。另外，MIC8參與的信號級放大反應(yīng)，也與棒狀體蛋白的分泌有關(guān)［10］。

4.4 AMA1是弓形蟲的一個重要抗原，與蟲體入侵宿主細胞的功能密切相關(guān)，從弓形蟲基因組中敲除AMA1基因，可明顯降低弓形蟲對宿主細胞的入侵能力。AMA1是保守的抗原蛋白［11］，能誘導(dǎo)特異性的Th1型免疫應(yīng)答，是最有希望的抗弓形蟲感染的候選疫苗之一。利用脂質(zhì)體將pcDNA3.1－AMA1導(dǎo)入真核細胞人胚胎腎細胞（HEK293細胞）中，經(jīng) Western blotting鑒定，AMA1基因在HEK293細胞中成功表達，并且能被特異性重組蛋白免疫血清所識別，說明AMA1蛋白在體外表達后具有一定的免疫活性，從而為進一步應(yīng)用AMA1－DNA疫苗免疫試驗動物和鑒定DNA疫苗的免疫效果奠定了基礎(chǔ)。

5 復(fù)合基因疫苗

5.1 RH 株 弓 形 蟲 復(fù) 合 基 因 質(zhì) 粒pc DNA3.1－SAG1－ROP2－GRA2［12］，并驗證重組質(zhì)粒在 Hela細胞中的表達后，以肌注方式接種BALB/c小鼠，測定血清中IgG的量、免疫小鼠脾細胞上清液中細胞因子的濃度及淋巴轉(zhuǎn)化實驗的結(jié)果，并用RH株弓形蟲速殖子對免疫小鼠進行攻擊感染實驗。動物實驗結(jié)果顯示，該質(zhì)粒誘發(fā)機體的全面免疫應(yīng)答，免疫動物產(chǎn)生高濃度的IgG抗體，細胞免疫呈Th1型，分泌INF－γ，而無IL－4產(chǎn)生，淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗及NK細胞殺傷實驗表明集體的非特異性免疫水平也有所提高，免疫小鼠能延長感染后小鼠的生存時間。質(zhì)粒pcDNA3.1－SAG1－ROP2－GRA2的免疫效果優(yōu)于 pcDNA3.1－SAG1－ROP2 及 pcDNA3.1－SAG1－GRA2。mIL－12對該基因的免疫效果起了很好的增強作用。

5.2 趙紅［13］采用弓形蟲速殖子表面抗原SAG1與ROP2基因定向連接并構(gòu)建在同一真核表達載體，通過滴鼻粘膜免疫小鼠，LTB作為免疫佐劑增強免疫效果。結(jié)果顯示，弓形蟲速殖子復(fù)合基因疫苗pcDNA3.1－SAG1－ROP2 質(zhì) 粒 和 p EASY－E1－LTB質(zhì)粒共同免疫較復(fù)合基因疫苗單獨免疫具有更好的免疫效果，其不僅能刺激機體產(chǎn)生較強的系統(tǒng)免疫應(yīng)答，而且也可誘導(dǎo)機體產(chǎn)生較強的局部黏膜免疫應(yīng)答。

5.3 姚遠［14］通過基因重組構(gòu)建了真核表達重組質(zhì)粒pcDNA3.1－SAG1－MIC8，與 單 基 因 質(zhì) 粒 pcDNA3.1－SAG1及pcDNA3.1－MIC8免疫小鼠，以研究復(fù)合基因疫苗效果。實驗中復(fù)合基因組總IgG抗體、特異性IgG抗體及細胞因子IFN－γ的數(shù)量均高于單基因免疫組，驗證了復(fù)合基因疫苗較之單基因疫苗具有更好的免疫效果。

6 猜 想

SAG1、ROP2和GRA2三者的復(fù)合基因疫苗、SAG1和ROP 2二者的復(fù)合基因疫苗及SAG1和MIC8二者的復(fù)合基因疫苗均比各自組成成分的單基因疫苗有更好的免疫效果。而MIC8參與形成的細胞融合區(qū)域非常重要，不可被其他的微線體蛋白來替代，也與棒狀體蛋白的分泌有關(guān)。由此猜測SAG1－ROP2－MIC8復(fù)合基因疫苗對弓形蟲具有更好的免疫效果。

［1］高世同，吳少庭，林敏，等.弓形蟲SAG2編碼基因真核表達質(zhì)粒接種后的細胞免疫效果［J］.中國人獸共患病雜志，2000，16（6）：431－432.

［2］Lee YH，Shin DW，Lee JH，et al.Vaccination against murine toxoplas－mosis using recombinantToxoplasmagondiiSAG3 antigen alone or in combination with Quil A.Yonsei［J］.Med，2007，48（3）：396－404.

［3］Vercammen M，Scorza T，Huygen K，et al.DNA vaccination with Genes encodingToxoplasmagondiiantigens GRA1，GRA7，and ROP2 induces partially protective immunity against lethal challenge in mice［J］.Infect Immun，2000，（3）：68，38－45.

［4］薛書江，張守發(fā)，欒楊.弓形蟲GRA3基因真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定［J］.河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，18（6）：48－51.

［5］Velmurugan GV，Tewari AK，Rao JR，et al.High－level expression of SAG1 and GRA7 gene ofToxoplasmagondii（Izatnagar isolate）and their application in serodiagnosis of goat toxoplasmosis［J］.Vet Parasitol，2008，154（3－4）：185－192.

［6］Sadeghiani G，Zare M，Babaie J，et al.Heterologous production of dense granule GRA7 antigen ofToxoplasmagondiiinEscherichiacoli.Southeast Asian［J］.J Trop Med Public Health，2009，40（4）：692－700.

［7］Jongert E，de－Craeye S，Dewit J，et al.GRA7 provides protective immunity in cocktail DNA vaccines againstToxoplasmagondii［J］.Parasite Immunol，2007，29（9）：445－453.

［8］Beghetto E，Nielsen HV，Del Porto P，et al.A combination of antigenic regions ofToxoplasmagondiimicroneme proteins induces protective immunity against oral infection with parasite cysts［J］.Journal of Infectious Diseases，2005，191（4）：637－645.

［9］Elaine V L，Emerson S B，Neide M S，et al.Immunization with MIC1 and MIC4 induces protective immunity againstToxoplasmagondii［J］.Microbes and Infection，2006，8：1244－1251.

［10］Kessler H，Herm－Gotz A，Hegge S，et al.Microneme protein 8－a new essential invasion factor inToxoplasmagondii［J］.Journal of Cell Science，2008，121：947－956.

［11］Zhang H，Compaore M K，Lee E G，et al.Apical membrane antigen 1 is a cross－reactive antigen between Neospora caninum andToxoplasmagondiiand the anti－Nc AMAl antibody inhibits host cell invasion by both parasites［J］.Mol Biochem Parasitol，2007，151（2）.205－212.

［12］薛明福.弓形蟲復(fù)合基因疫苗SAG1－ROP2－GRA2的免疫保護性研究［D］.濟南：山東大學(xué)，2008：38－42.

［13］趙紅.弓形蟲SAG1－ROP2復(fù)合基因疫苗與免疫佐劑大腸埃希菌腸毒素B亞基對小鼠的免疫保護性研究［D］.濟南：山東大學(xué)，2010：43－47.

［14］姚遠.弓形蟲SAG1－MIC8復(fù)合基因疫苗對小鼠的免疫保護性研究［D］.濟南：山東大學(xué)，2009：53－56.