弓形蟲微線體蛋白MIC3的研究進展＊

江 濤

弓形蟲（Toxoplasmagondii）的微線體（microneme）散布于蟲體前端棒狀體周圍，是一種具有分泌功能的細胞器，其分泌的微線體蛋白（microneme proteins MICs）與蟲體對宿主細胞的識別和結合密切相關，在蟲體入侵宿主細胞早期發揮重要作用［1］。目前發現的微線體蛋白有15種以上，包括 MIC1－MIC12、AMA1、SUB1、SUB2等［2］，MIC3是其中重要的一種微線體蛋白。由于MIC3在弓形蟲的速殖子、緩殖子和子孢子期都能表達，被認為是在弓形蟲病的診斷和疫苗研制上非常有前景的候選分子［3－4］。

1 MIC3的結構

MIC3于1991年發現，Achbarou等［5］研究表明MIC3分子量約為90 k D，由2個38 k D的多肽組成，其等電點分別為6.75和6.70，均可被相同的單克隆抗體識別，認為2條多肽鏈是同源的，且通過二硫橋連接在一起。Garcia－Reguet等［6］首次對MIC3基因的堿基序列進行了鑒定分析，發現MIC3基因是單拷貝基因，不含內含子，ORF編碼395個氨基酸殘基的多肽，MIC3含有34個半胱氨酸，等電點為5.98，推導有12個磷酸化位點，1個潛在的N－糖基化氨基酸共有序列Asn－X－Ser/Thr位于肽鏈的201處，MIC3蛋白序列含有5個表皮生長因子樣（epidermal growth factor－like，EGF）結構域和1個氨基端的類幾丁質（chitin binding－like，CBL）模體。EGF1～EGF5分別位于aa118～159、147～189、190～236、237～290和263～343，其中EGF2－3串聯排列，EGF1和EGF5分別與EGF2和EGF4部分重疊；CBL模體中含有8個能夠形成二硫鍵的半胱氨酸和3個高度保守的芳香族殘基。MIC3蛋白N端有一個26個氨基酸的疏水信號肽，無跨膜區域，應用Edman降解法對N－末端微序列進行分析發現，40個氨基酸的前肽序列位于信號肽序列切割點下游，顯示MIC3在其生物合成期間必須進行加工處理，推導切除前肽和信號肽后的預測分子量與MIC3一個成熟亞單位的表觀分子量（38 k D）非常吻合。Cérède等［3］進一步研究分析發現弓形蟲速殖子體內的MIC3是一種90 k D的蛋白質。在分泌轉運途徑中及貯存前合成的是40 k D蛋白質前體，經蛋白酶水解成為38 k D終產物，并折疊成90 k D二聚體。將編碼全長MIC3的核苷酸序列克隆入哺乳動物表達載體pcDNA3，然后轉染BHK－21細胞進行瞬時表達，用 Western－blot分析轉染細胞裂解物，發現在未還原條件下重組MIC3是100 k D二聚體，在還原條件下是42 k D單體，與弓形蟲中分離提純的天然MIC3二聚體（90 k D）和單體（38 k D）存在差異。認為切割MIC3前體的蛋白水解酶是弓形蟲所特有，哺乳動物細胞中缺乏該酶，不能對MIC3進行前體肽的降解，但可折疊成二聚體（100 k D）。雖然哺乳動物細胞表達的重組MIC3二聚體或單體不能有效地與宿主細胞表面結合，但仍然保留其與相應抗體發生特異性結合的性質。2條38 k D多肽還可通過蛋白質間的相互作用連接形成成熟的90 k D二聚體。Ismael等［4］的研究也得出了同樣的結論。

江濤等［7］采用分子生物信息學軟件對全長的MIC3的二級結構和B細胞抗原表位進行預測。發現該蛋白結構中含有較多的α－螺旋區段，主要集中分布于蛋白質的兩端；非常豐富的β－轉角，比較集中地分布在蛋白質的中間區域；較多的無規則卷曲，其結構比較松散、突出，易于形變，多位于蛋白質分子表面。MIC3的B細胞抗原表位的優勢區域位于N端第83～94、136～141和240～243區段內或其附近。

2 MIC3的功能

Cérède［3］通過細胞轉染試驗觀察到，Vero細胞能與天然的MIC3強烈結合，但不能與重組MIC3（r MIC3）反應，認為裂解 MIC3前肽的蛋白酶是弓形蟲特有，前肽序列的存在阻礙了這種結合（粘附），但并不妨礙二聚體的形成。信號肽能引導MIC3的正確分泌、轉運與定位，而切除信號肽的重組MIC3也能結合到宿主細胞的表面，共聚焦技術分析發現MIC3能通過直接與宿主細胞表面受體結合而發揮作用。還發現EGF樣結構域不參與MIC3對宿主細胞受體的識別，或者單獨的EGF樣結構域不能提高MIC3對宿主細胞的粘附力，但有助于正確呈現粘附模體的結構，可能在其構象形成中發揮作用，并且EGF樣結構域還參與MIC3和其陪護伴侶MIC8形成MIC3－MIC8復合體。CBL序列是弓形蟲的粘附模體，二聚體的形成是CBL模體發揮作用的重要因素。CBL結構域含有的半胱氨酸和高度保守的芳香族殘基，可以保證蛋白結構的正確折疊和與宿主細胞膜上N－乙酰葡萄糖胺的結合。

Cérède等［8］進一步研究發現，將 MIC3的 CBL結構域上的126位色氨酸替換成甘氨酸、128位苯丙氨酸替換成甘氨酸的突變株對小鼠的侵染能力明顯下降，攻蟲感染40 d后的小鼠存活率分別為83.3%和95% 。表明MIC3上的CBL結構域與弓形蟲侵染細胞能力有密切關系。

3 MIC3的應用

3.1 在疫苗上的應用 Ismael等［4］用編碼不成熟MIC3的質粒p MIC3i肌肉免疫接種CBA/J小鼠，結果全部小鼠血清中抗p MIC3i特異性抗體IgG滴度很 高，出 現 大 量 的 IFN－γ 及 IL－2、IgG2a 和IgG2b，說明p MIC3i能激發強烈的體液免疫和細胞免疫；用編碼粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子基因的質粒p GM－CSF與質粒p MICi3聯合免疫接種小鼠后，能產生更顯著的體液免疫應答和細胞免疫應答；小鼠經3次免疫后，口服弓形蟲76 K株包囊，1月后經檢測其大腦內的包囊數量明顯少于對照組小鼠，且聯合免疫接種對小鼠能起到更好的保護作用。

Ismael等［9］將弓形蟲RH株的 MIC1和 MIC3基因敲除，構建 MIC1－3KO突變株，腹腔注射小鼠（20個速殖子/只），能激發強烈的體液免疫和Th1型細胞免疫，血清中IFN－γ、IL－2、IL－10的滴度明顯增加；71 d后以蟲株76 K卵囊45個口服感染免疫小鼠，發現小鼠大腦組織中弓形蟲包囊數比對照組減少96%以上。Mévélec［10］以105個 MIC1－3KO 株速殖子皮下接種3組母羊，只出現輕度的發熱反應。免疫母羊1月后配種，在妊娠中期口服弓形蟲PRV株卵囊（1、2組分別400個，3組100個），同時設未免疫對照組，結果發現試驗組母羊只出現輕微體溫升高，所產羔羊未見弓形蟲感染的臨床癥狀，3組羔羊的存活率分別為62%、91%和64%。說明MIC1－3KO蟲株與S48蟲株有相同的免疫效果，認為MIC1－3KO蟲株是具有開發應用潛力的疫苗。

江濤等［11］構建了弓形蟲RH株 MIC3基因的原核表達質粒載體p GEX－KG－MIC3，其表達產物r MIC3主要以包涵體形式存在，Western－blot試驗可被兔抗弓形蟲免疫血清識別，顯示有良好的反應原性。以純化、復性的r MIC3混合免疫佐劑皮下注射Balb/c小鼠，6 w血清特異抗體滴度和攻蟲后小鼠的平均存活時間與對照組比較有明顯提高［12］。構建MIC3基因的真核表達質粒pc MIC3轉染IBRS－2細胞后，其表達的蛋白質具有良好的免疫活性［13］；再將質粒pc MIC3以肌肉注射的方式間隔2 w 3次免疫Balb/c小鼠，同時設空載體pc DNA3.1和PBS對照。在首免后第8 w分別以MTT比色法和CTL法測定小鼠脾淋巴細胞的增殖應答和細胞毒性T細胞（CTL）毒活性。與對照組相比，免疫小鼠脾淋巴細胞和CTL毒活性均極顯著增強（P＜0.01）。表明pc MIC3質粒免疫的小鼠能誘導強烈的細胞免疫反應和體液免疫反應。在免疫8 w后以弓形蟲RH強毒株攻擊，第45 d的平均生存率達78%，而對照組在7.5～9 d時全部死亡［14］。

張燕麗等［15］構建了弓形蟲GJS株MIC3基因的真核表達質粒pcDNA－MIC3，轉染BHK－21細胞后，表達產物可被羊抗弓形蟲超免血清識別，具有良好的抗原性；pcDNA－MIC3質粒肌肉注射Balb/c小鼠，血清中出現高滴度的特異抗體，對GJS蟲株的攻擊產生較強抵抗力。

Fang等［16－17］構 建 了 弓 形蟲 RH 株 MIC3 基 因的自殺性重組質粒載體pSCA/MIC3和重組桿狀病毒疫苗 Ac－V－MIC3，能高效轉染（導）哺乳動物BHK－21細胞和PK－15細胞，并進行有效表達；分別免疫Balb/c小鼠，均能產生強烈的體液免疫和細胞免疫，并有效抵抗致死性蟲株的攻擊。

3.2 在 診 斷 上 的 應 用 江 濤 等［18－19］以 純 化 的r MIC3作為抗原建立了乳膠凝集試驗（LAT）和ELISA等2種弓形蟲病診斷方法，檢測人工試驗感染弓形蟲豬，發現分別在感染的4～57 d、14～57 d可查到血清中特異性抗體，且分別在8～45 d、18～45 d的檢測陽性率達100%（8/8），2種方法檢測衣原體、胸膜肺炎放線桿菌、口蹄疫病毒、豬瘟病毒、旋毛蟲、圓環病毒、副豬嗜血桿菌、偽狂犬病病毒及附紅細胞體陽性血清均為陰性，具有特異性高、反應靈敏、操作簡便等特點，優于以蟲體天然成分為抗原建立的IHA。張東林等［20－21］以r MIC3為抗原建立SPA－ELISA和AG－ELISA，檢測豬、山羊等動物弓形蟲感染，操作簡便、快速，效果良好。張源源等［22］以原核表達的r Tg MIC3為抗原建立ELISA，用于檢測22只實驗感染弓形蟲ME49株7 d后的小鼠血清抗體，陽性率為100%，而12只實驗感染牛新孢子蟲的小鼠血清均為陰性，表明以r Tg MIC3為包被抗原的ELISA檢測弓形蟲抗體具有較高的敏感性和特異性。

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