基因芯片技術在中藥腫瘤藥理研究中的應用

王珊珊，廖清船，許靜，徐康康（南京醫科大學附屬南京兒童醫院，南京市210008）

人體是一個復雜的網絡系統，疾病的發生和發展必然牽涉到網絡中的諸多環節。基因芯片技術的出現使綜合、系統分析某些生命現象成為可能。它可以同時進行許多基因的檢測，徹底改變了傳統的分子生物學方法只能對某一個或某幾個基因進行研究的局限。而基因芯片可以從疾病和藥物兩個角度對生物體的多個參量同時進行研究，以發掘藥物靶點并同時獲取大量其他相關信息。因此在這種情況下，任何一元化或相對一元化的分析方法均不及基因芯片的分析手段更具有優勢[1，2]。

采用基因芯片對基因表達進行分析，可隨時獲取腫瘤細胞生長各期與腫瘤生長相關基因的表達模式，以對腫瘤的發生、發展有一個系統、深入的闡析[3]。現代藥理學分子水平的研究已明確藥物作用都有其“靶基因”，基因芯片技術的出現為我們提供了一個從基因層次全面探討中藥腫瘤藥理的契機[4]。基因芯片以高通量、多因素、微型化和快速靈敏的特點而見長，能夠針對中藥的多成分、多途徑、多系統、多靶點的作用特點進行系統深入的研究，為探索中藥抗腫瘤的作用機制、毒副作用、作用新靶點及藥物篩選等現代中藥研究開辟了嶄新的領域。

1 基因芯片技術概述

基因芯片是融微電子學、生物學、物理學、化學及計算機科學為一體的高度交叉的新技術，具有重大的基礎研究價值和明顯的產業化前景，是目前生物技術的熱點和前沿。基因芯片是將許多特定的DNA寡聚核苷酸或DNA片段（稱為探針）固定在芯片的每個預先設置的區域內，通過堿基互補配對原則進行雜交，檢測對應片段是否存在及其存在量。該技術可用于基因的功能研究和基因組研究、疾病的臨床診斷和檢測等方面[5]。在中藥腫瘤藥理研究中，可用基因芯片尋找藥效相關基因，該芯片既可用于藥效物質的檢測和遺傳多態性的檢測，又可用于受檢藥效物質作用機制的研究，同時還可用于藥效相關基因的功能研究。

2 基因芯片技術在中藥腫瘤藥理研究中的應用

腫瘤是一種涉及多個階段、多條通路、多個基因的病變，基因芯片的發明和應用，為研究腫瘤細胞或組織中基因表達的差異及基因表達差異譜的建立，提供了一種非常快捷、方便、準確的方法。中藥抗腫瘤的藥理作用還具有多組分、多途徑、多靶點的特點，采用“利用基因芯片建立基因表達差異譜”技術，可以全面研究中藥對基因表達水平的影響，從而為揭開中藥作用的“黑匣子”提供有效的依據。

2.1 在中藥抗腫瘤作用機制研究中的應用

藥物發揮功效主要通過不同的作用靶點作用于組織細胞，直接或間接地影響細胞內基因的表達。鑒于中藥抗腫瘤作用機制的復雜性，利用高密度的基因芯片檢測給藥前后基因表達譜的差異是研究者開展中藥腫瘤藥理研究的共同途徑。

2.1.1 在抗腫瘤單體化合物作用機制研究中的應用 陳明偉等[6]采用基因芯片技術檢測人參皂苷Rg3對人肺腺癌細胞株A549細胞基因差異表達的影響，從基因水平進一步探討其作用的靶點。結果顯示，10-6mol·L-1濃度Rg3對A549細胞基因表達有顯著影響，其中表達下調的基因有14個，分別是原癌基因和抑癌基因TNFAIP3、SAFB和MN1，蛋白翻譯合成基因STIP1和EEF2，既有DNA合成修復和重組蛋白作用，又有代謝功能的基因POLG、免疫相關基因CD1及其他功能基因7個。表達上調的基因有10個，它們是蛋白翻譯合成基因NCOA2、代謝相關基因POLR3K、細胞信號和傳遞蛋白VRK1和KIAA0164、細胞骨架和運動基因KIAA0133、HSPG和其他功能基因4個。可見，Rg3可同時作用于A549細胞多個靶點。黃益玲等[7]通過基因表達譜分析首次提出天花粉蛋白誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡的作用機制，發現與細胞凋亡密切相關的NOP56、TN-FSF10、CASP9、DFFB等62條基因表達上調，與細胞黏附及細胞間相互作用相關的COL9A3、MGST3、LGALS3BP等16條基因表達下調。這些研究從基因芯片表達的角度探索中藥的分子層面作用機制，為進一步闡明復方和復雜網絡奠定了基礎。

2.1.2 在抗腫瘤單味中藥作用機制研究中的應用 王懷宇等[8]應用包含1 003條人類基因的cDNA表達譜芯片檢測雄黃作用于急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4前后基因表達的變化。NB4細胞在雄黃作用12 h后，共有9條基因上調，37條基因下調，其中2條參與蛋白酶體降解途徑的基因顯著上調，多條與細胞信號傳導、RNA加工及蛋白質合成相關的基因下調。提示PSMC2、PSMD1及ITGB1基因表達的改變可能與NB4細胞的分化和凋亡有密切關系。

Iizuka N等[9]對黃連水提物及單體成分小檗堿的作用進行了對比研究，結果發現藥材的水提液要比純單體成分在殺傷腫瘤細胞方面更有效，并且借助含有11 000個基因的單核苷酸序列分析癌細胞系給藥前后基因表達譜的差異，闡明兩者的分子機制有不同之處。其中，癌細胞中的RECQL基因（可通過修復癌細胞DNA而引起多藥耐藥性）表達水平的增高與耐受小檗堿呈正相關，但對黃連水提液則無此效應；另外拓樸異構酶Ⅱα（TOP2A）的mRNA水平也與耐受小檗堿呈正相關，對黃連水提液也無此效應。原因可能是藥材的提取液中含有多種小檗堿的衍生物，它們對癌細胞的拓樸異構酶Ⅱ和拓樸異構酶Ⅰ都能起作用，因此從更深層次上解釋了黃連水提液抗癌細胞效果強于小檗堿單體的藥理機制。

2.1.3 在抗腫瘤中藥復方作用機制研究中的應用 基因芯片可以將中藥復方多組分、多靶點、多途徑的作用特點與基因表達聯系起來，比較各自不同的表達差異譜，根據不同配伍組方對應基因靶點的相互作用，分析各組成復方單藥之間的密切關系，闡明藥物作用的物質基礎及內在的配伍規律。趙愛光等[10]通過cDNA微陣列的方法，初步研究健脾類中藥胃腸安復方在體內對人胃癌SGC-7901細胞基因表達譜的影響。對照組與胃腸安復方組間共有45個2倍以上差異顯著的表達信號，分別為24個上調基因和21個下調基因，進行初步分類后發現胃腸安復方組對SGC-7901細胞基因表達的影響可能涉及癌基因、細胞分裂相關基因、分化/發育相關基因、調亡基因、細胞受體、信號轉導、免疫相關、代謝相關及其他基因等10類。沈曄華等[11]研究了中藥清胰消積方對裸鼠體內人胰腺癌SW1990細胞移植瘤的抑瘤作用，并利用基因表達譜芯片探索其作用機制，發現調節癌基因及其相關的信號傳導、改變腫瘤細胞蛋白合成等可能是其作用機制。中藥復方成分復雜，采用傳統的研究方法，或從影響細胞增殖、或從影響凋亡、或從免疫調節等單個環節進行研究，工作缺乏系統性，也無法探求其主要的作用環節和靶點或對其多重作用之間有無內在的聯系作出令人較為信服的解釋。cDNA微陣列的出現，使探討中藥復方對腫瘤細胞在基因表達水平的主要作用環節和靶點成為可能。

2.2 在抗腫瘤中藥毒副作用研究中的應用

某些具有抗腫瘤藥理效應的中藥，也可能同時干擾正常細胞組織代謝的其他環節而導致毒副作用，某些抗腫瘤中藥中的毒性成分又是有效成分。因此，了解其劑量與毒副作用之間的關系非常重要。觀察藥物處理后細胞、組織和器官基因表達的差異，可以對藥物的毒性程度及代謝特點有初步的了解。將可能受中藥毒性影響的基因，包括凋亡、細胞周期調控、藥物轉化和代謝、DNA復制及修復、熱休克、氧化應激反應等相關的基因，制備成基因芯片，從動物或暴露于藥物的培養組織中提取的相匹配遺傳物質與芯片上的探針結合，根據檢測到的信息分析藥物中的有毒成分，從而采取防護措施，控制劑量范圍，尋找拮抗藥物等，以避免毒副作用的發生[12]。

2.3 在發現中藥抗腫瘤新靶點中的應用

在藥物開發過程中發現和選擇合適的藥物靶點是藥物開發的第一步，也是藥物篩選和藥物定向合成的關鍵因素之一。藥物靶點發現與藥物作用機制研究是生物芯片技術在藥物研發中應用最為廣泛的一個領域。例如，鬼臼亞乙苷是p53活化拓撲異構酶Ⅱ的抑制劑，在臨床上作為一種抗腫瘤藥物。Wang Y等[13]經用鬼臼亞乙苷作用人成骨肉瘤細胞系U2-OS后，根據不同的時間間隔分別提取細胞mRNA，用寡核苷酸芯片測定6 591條mRNA表達的變化，發現62條mRNA表達有變化。通過選取其中12條基因作進一步研究，發現有2條是已知的p53調控基因（WAF1/p21和PCNA），有2條是新的p53靶基因，其余的與p53無關。在實驗基礎上，他們提出了介導鬼臼亞乙苷誘導細胞凋亡的信號傳導途徑，這使我們又多獲得一種抗腫瘤藥物的靶點。

2.4 在中藥抗腫瘤新藥篩選中的應用

用基因芯片大規模平行分析基因表達的情況，從而進行新藥的研究和開發可以節省大量的動物實驗，甚至臨床試驗，還可進一步分析藥物對靶細胞及非靶細胞的毒性作用，確定藥物臨床應用的可行性及最佳的用藥劑量，從而為新藥的開發提供一種高速度、高靈敏度的安全指標，降低用藥風險，抗腫瘤中草藥的篩選與開發是研究的熱點領域[14]。

2.4.1 中藥抗腫瘤新藥篩選研究近況 建立腫瘤疾病的基因芯片，并以此檢測藥物作用后基因的表達差異，從而對單味藥的各種化學成分或不同的復方進行篩選和分析，找出確定的有效成分或合適的組方供進一步進行新藥研究。Hara A等[15]利用寡核苷酸芯片分析抗腫瘤草藥黃連根及其8個組成分子的12 600個基因，經過生物信息學處理，最終確定黃連素是黃連抗增殖的效應部位，并佐證了DNA芯片用于單味中藥的效應部位分析。

托婭等[16]利用基因芯片技術，以人胃癌BGC823細胞和血管內皮細胞（EC）對中藥提取物T3進行篩選。發現T3對2種細胞系的基因表達譜均有明顯影響，其抗腫瘤的機制是多途徑、多方面的，可能通過阻斷介導的細胞信號轉導通路引起一系列級鏈反應，最終使腫瘤細胞發生凋亡，并且對抑制腫瘤細胞的侵襲和轉移有一定的作用。利用高密度芯片技術可以從中藥中尋找新的有效成分，是目前一大趨勢。

2.4.2 中藥抗腫瘤新藥篩選研究思路及方法 腫瘤的發生除腫瘤細胞自身存在眾多的基因表達外，它更是一個全身性疾病的局部反應，是機體作為一個生物系統的整體平衡失調的結果。將腫瘤作為全身性病變進行藥物篩選，應用基因芯片技術研究中藥在腫瘤發生不同階段中的相關靶組織的基因變化，從研究其能提高哪些基因的表達，抑制哪些基因的表達著手，了解與中藥能起反應的基因。用基因表達差異譜篩選中藥抗腫瘤藥物，為中藥現代化研究提供了一個全新的思路和方向[17]。其方法為：（1）建立腫瘤的動物模型，尋找腫瘤相關靶組織：建立腫瘤的動物模型，設立相同數量的模型組和對照組。根據中醫整體觀的思想，選取動物機體主要組織，利用基因芯片，通過組織中總RNA的提取、標記探針的制備、與芯片的雜交、芯片掃描、計算機圖像數據處理后，即可建立各組織的腫瘤-正常基因表達譜。排除基因表達無差異的組織，有差異組織即為腫瘤的相關靶組織。（2）建立腫瘤發生不同階段的相關靶組織的疾病-正常基因表達差異譜：根據腫瘤發生的不同階段，用基因芯片對相關靶組織進行檢測，建立腫瘤發生的不同階段相關靶組織的疾病-正常基因表達差異譜，為全面認識腫瘤，發現新的病理機制提供依據。（3）建立藥物-對照基因表達差異譜：有根據地選擇一系列中藥單體化合物、單味中藥和中藥復方，設立低、中、高3個劑量組和正常對照組，觀察其在腫瘤發生的不同階段中對腫瘤的相關靶組織基因表達的影響，建立藥物-對照基因表達差異譜，用于中藥抗腫瘤藥物的篩選。

采用高通量基因芯片篩選方法快速篩選出有效成分，并快速完成藥理學試驗，利用計算機分析各種成分間相互作用關系，繪制出中藥復雜成分間相互作用的圖譜，觀察它們對基因表達的影響，對認識中藥作用的靶基因，闡明抗腫瘤中藥的作用機制、毒副作用、作用新靶點及藥物篩選是非常有效的手段，可大大加快中藥現代化進程。

3 基因芯片存在的缺陷

基因芯片已廣泛應用于人體腫瘤分析，其高速度、高效率和大信息量的特點遠優于傳統基因分析法。但基因芯片在腫瘤研究中也有缺點，如Northern雜交出的差異表達基因經microarray篩選有可能漏檢；另外DNA芯片上原位合成探針難免有錯誤核苷酸摻入及混入雜質，使整個雜交背景增高，降低特異性。可見，如何排除這些無關基因的影響也是一個目前研究的重要課題。

基因芯片技術是一種非常行之有效的手段，但如何正確地分析所得的大量信息存在一定的困難，主要是缺乏足夠的生物信息學知識支持。此外，細胞行使功能的是蛋白質等成分，由DNA到mRNA再到蛋白質這個基因表達的全過程有許多的調控因素，僅僅明白其中的一段是遠遠不夠全面的。而在許多情況下，細胞內mRNA的含量并不與細胞內相應蛋白質的含量相關；蛋白質只需要經過磷酸化/去磷酸化等簡單的修飾，就可以極大地改變活性，而基因表達的變化則受到許多復雜因素的影響。

4 結語

近年來，分子生物學知識和技術突飛猛進，取得了巨大成就，為生命科學領域注入了新的活力。分子生物學是從微觀的分子水平研究生命，這與以“整體觀念”為指導思想的中醫藥學存在極大的差異。如何用中醫藥理論解讀分子生物學技術所取得的海量數據，如何用這些數據詮釋和發展中藥藥理學，是分子生物學與中藥藥理學融合的根本所在，也是難點所在。在中藥藥理學中應用分子生物學技術必須以中醫藥理論為指導，以現代中藥藥理學研究為基礎，借鑒西藥藥理學現代研究思路，綜合現代植物化學、分析技術，運用系統生物學知識，實現從理論到技術的系統結合。中醫藥理論及中藥和其復方的特殊性，使得探索的過程充滿艱辛，但分子生物學的引入必然引起中藥藥理學質的飛躍，促進中藥腫瘤藥理規范發展也是毋庸置疑的。只有當基因芯片同其他技術有機結合時，才能在中醫藥現代化這一系統工程中發揮最佳作用。

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