煙草基因組學研究方法篇：5.煙草蛋白質組學研究方法和應用

王紹美

（中國農業科學院煙草研究所，青島 266101）

蛋白質組（proteome）最初指細胞內全部蛋白質的存在及其活動方式，后引申指一個基因組編碼的全部蛋白質。蛋白質組研究是生命科學研究進入后基因組時代的里程碑，也是后基因組時代生命科學研究的核心內容之一和功能基因組學研究的新興學科、熱點領域。蛋白質組學研究方法主要是基于蛋白質樣品的分離、蛋白質的鑒定及蛋白質間的相互作用等技術。

1 蛋白質組學研究方法

1.1 蛋白質的分離技術

用于蛋白質分離的技術有雙向電泳（two-dimensional electrophoreisis,2-DE）、熒光差異雙向凝膠電泳（two dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE）、高效液相色譜（RP-HPLC）、毛細管電泳（capillary electrophoresis,CE）、多維液相色譜（MDLC）等技術。其中最主要的技術是雙向電泳和高效液相色譜。2-DE基本原理是根據蛋白質等電點和分子量大小不同，先后在兩個方向上分離蛋白質復雜組分[1]。這種技術具有分辨率和靈敏度較高，可用于計算機定量分析差異表達蛋白質，用高靈敏度微量化學方法較易對2-DE膠上的分離蛋白質進行鑒定和表征的特點，因此，目前仍是蛋白質分離的核心技術，適宜于進行比較蛋白質組學分析。該技術的缺點是疏水性蛋白（如膜蛋白）難溶于樣品緩沖液；高分子量蛋白、極酸和極堿性蛋白易在電泳中丟失；低豐度（拷貝數小于1000）蛋白無法檢測等。RP-HPLC作為蛋白質分離和純化的最常用方法，一般是將液相色譜分離技術與串聯質譜聯用，首先酶解混合蛋白，再經過適當的色譜分離，并通過串聯質譜分析肽段、鑒定蛋白。這項技術將色譜與質譜結合實現了高通量篩選和進行蛋白質混合物鑒定，操作過程簡單、分析速度快、分離能力好、靈敏度高，能富集低豐度蛋白，可迅速、完全自動化鑒定極微量蛋白質，但不適用比較蛋白質組學分析。

1.2 蛋白質的鑒定技術

用于蛋白質鑒定的技術主要有傳統蛋白質鑒定技術、生物質譜鑒定（mass spectrometry,MS）技術和同位素標記親和標簽法（isotope-coded affinity tags,ICAT）。傳統蛋白質鑒定技術指Edman降解法測N端序列和氨基酸組成分析法，前者有測定速度較慢，費用偏高，靈敏度低等缺點；后者因耗資低而常用于蛋白質的鑒定。MS技術因其具有高通量、高準確度、高靈敏度、易于自動化、快速等優點，適用于分析凝膠上的微量蛋白，成為蛋白質鑒定的主要支撐技術。該技術基本原理是先使蛋白質樣品分子離子化，然后根據不同離子之間的質荷比（m/z）差異來分離并確定蛋白質相對分子質量，再根據蛋白質酶解后所得到的肽質量指紋圖譜（PMF）、肽序列標簽（PST）和肽階梯序列（PLS）去檢索蛋白質或核酸序列庫[2]。生物質譜分析系統根據離子源不同分為基質輔助激光解析電離質譜（matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry,MALDI-MS）和電噴霧電離質譜（electrospray ionization mass spectrometry,ESI-MS）。ICAT是采用同位素標記多肽或蛋白質的親和標簽技術，具有靈敏度和準確性高的特點，能用于快速定性和定量鑒定疏水性和低豐度蛋白質，并可直接測試混合樣品，進行差異表達蛋白質研究。

1.3 蛋白質相互作用研究技術

應用于蛋白質相互作用的研究技術有酵母雙雜交（yeast two-hybrid，Y2Z）系統、噬菌體展示（phage display）技術、蛋白質芯片（protein chip）技術、基于質譜的蛋白質相互作用研究方法等。酵母雙雜交系統技術原理是在真核模式生物酵母中，當靶蛋白和誘餌蛋白特異結合后,形成轉錄激活復合物，誘導已知基因的啟動子，從而啟動報告基因在酵母細胞內的表達，通過檢測該基因表達產物而判別誘餌蛋白和靶蛋白之間是否存在相互作用。該技術具有易于自動化高通量等特點，已成為研究蛋白質相互作用、蛋白質結構與功能、繪制蛋白質相互作用圖譜的重要手段，但分析過程中存在假陽性和假陰性的現象。噬菌體展示技術是在編碼噬菌體外殼蛋白的pⅢ或pVⅢ基因上連接一個單克隆抗體基因序列的技術。噬菌體生長時表面表達出的相應單抗在過柱時，目的蛋白質可特異性結合相應抗體。該技術具有高通量及簡便的特點，它可以檢測出酵母雙雜交技術檢測不出的本身具有激活轉錄活性的蛋白質。蛋白質芯片技術是一種高通量、微型化和自動化的蛋白質酶聯免疫分析技術。該技術的基本原理是將高度密集排列的蛋白分子作為探針點陣固定在固相支持物上，當與待測蛋白樣品反應時，可捕獲樣品中的靶蛋白，再經檢測系統對靶蛋白進行定性和定量分析。

2 蛋白質組學研究方法在煙草中的應用

2.1 應用于基礎研究

煙草作為模式生物應可用于蛋白質組學基礎研究領域。煙草的Bright-Yellow-2（BY2）細胞系是從煙草幼苗愈傷組織中獲得的，該細胞系具有快速生長、易于遺傳轉化、細胞分裂同步等優點，是目前植物基礎研究領域應用最廣泛的細胞系之一。Duby等[3]以BY2細胞系作為實驗材料，構建了可供蛋白質快速網上鑒定和蛋白質圖譜比對的BY2細胞系蛋白質組參考圖譜。2008年，Gerber等[4]在煙草BY2細胞系中研究了細菌脂多糖誘導的細胞靶點信號蛋白質組圖譜。Goulet等[5]用Nicotiana benthamiana葉片研究質外體蛋白質組的結果，將成為植物與病菌互作或細胞壁代謝以及細胞壁分泌蛋白研究的有用工具。

2.2 應用于逆境脅迫研究

煙草在生長過程中遭受的各種生物脅迫和非生物脅迫會造成煙葉產量、質量下降，這些逆境脅迫會通過逆境感知信號來調控細胞內抗逆相關蛋白質的合成表達，以調整自身生理狀態和外部形態適應外界環境變化。為了解釋煙草抗逆機制、提高煙草抗逆性，Pineda等[6]、Razavizadeh等[7]、Dani等[8]、王紹美[9]、蓋英萍[10]、梁景霞[11]分別對生物脅迫和非生物脅迫下煙草蛋白質組進行了研究。

2.3 應用于代謝調控途徑研究

煙草的代謝調控直接影響煙葉的化學成分協調，從而影響煙葉內在品質。2010年，Kaida等[12]研究了紫色酸性磷酸酶在煙草細胞壁蛋白質去磷酸化中的潛在作用；Chivasa等[13]對信號調節物 eATP的影響展開了代謝調控蛋白質組研究。2009年，Millar等[14]開展了煙草細胞系形成次生壁的細胞壁和分泌蛋白質組研究。王茂等[15]進行了信號誘導物結合栽培措施的代謝調控研究。

2.4 不同生態類型煙葉香氣風格形成機理研究

我國生產的煙葉因生態條件的影響而具有不同的香氣風格，運用蛋白質組學研究可以探討煙草應答不同生態條件的分子機理和不同生態類型形成不同香氣風格的機理[16]。

[1]G?rg A,Weiss W,Dunn M J.Current two-dimensional electrophoresis technology for proteomics[J].Proteomics,2004,4:3665-3685.

[2]Shi R,Kumar C,Zougman A,et al.Analysis of the mouse liver proteome using advanced mass spectrometry[J].J Proteome Res,2007,6:2963-2972.

[3]Duby G,Degand H,Faber A M,et al.The proteome complement ofNicotiana tabacum Bright-Yellow-2culture cells[J].Proteomics,2010,10:2545-2550.

[4]Gerber I B,Laukens K,De Vijlder T,et al.Proteomic profiling of cellular targets of lipopolysaccharide-induced signalling inNicotiana tabacumBY-2 cells[J].Biochim Biophys Acta,2008,1784:1750-1762.

[5]Goulet C,Goulet C,Goulet M C,et al.2-DE proteome maps for the leaf apoplast ofNicotiana benthamiana[J].Proteomics,2010,10:2536-2544.

[6]Pineda M,Sajnani C,Baron M.Changes induced by thePepper mild mottle tobamoviruson the chloroplast proteome ofNicotiana benthamiana[J].Photosynth Res,2010,103:31-45.

[7]Razavizadeh R,Ehsanpour A A,Ahsan N,et al.Proteome analysis of tobacco leaves under salt stress[J].Peptides,2009,30:1651-1659.

[8]Dani V,Simon W J,Duranti M,et al.Changes in the tobacco leaf apoplast proteome in response to salt stress[J].Proteomics,2005,5:737-745.

[9]王紹美.抗性不同的烤煙品種在脅迫條件下煙葉的差異蛋白質組學研究[D].北京：中國農業科學院，2011.

[10]蓋英萍.棉花、煙草響應低溫脅迫的差異蛋白質組學研究[D].泰安：山東農業大學，2008.

[11]梁景霞.煙草種質ISSR標記及對氮素響應的生理遺傳與差異蛋白質組學研究[D].福州：福建農林大學，2008.

[12]Kaida R,Serada S,Norioka N,et al.Potential role for purple acid phosphatase in the dephosphorylation of wall proteins in tobacco cell[J].Plant Physiol,2010,153:603-610.

[13]Chivasa S,Simon W J,Murphy A M,et al.The effects of extracellular adenosine 5′-triphosphate on the tobacco proteome[J].Proteomics,2010,10:235-244.

[14]Millar D J,Whitelegge J P,Bindschedler L V,et al.The cell wall and secretory proteome of a tobacco cell line synthesising secondary wall[J].Proteomics,2009,9:2355-2372.

[15]王茂，張翀，劉衛群.茉莉酸處理烤煙打頂誘導煙堿合成調控相關蛋白質的篩選[J].河南農業大學學報，2009，43（3）：236-255.

[16]崔紅，冀浩，張華，等.不同生態區煙草葉片蛋白質組學的比較[J].生態學報，2008，28（10）：4874-4880.