促紅細胞生成素對低氧狀態下神經干細胞損傷的保護作用

姚 敏 陳 維 (吉林大學中日聯誼醫院，吉林 長春 130033)

神經干細胞(neural stem cell，NSC)是具有多種分化潛能的神經前體細胞，NSC移植技術對治療多種神經系統疾病有著廣泛的前景。近年來，國內外學者研究發現，促紅細胞生成素(erythropoietin，EPO)除調控紅系祖細胞增殖、分化及成熟外，還與中樞神經系統的生長、發育密切相關。本實驗旨在研究低氧環境下，EPO對NSC缺氧性損傷的保護作用，為NSC移植技術最終應用于臨床提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 DMEM/F12培養基(Gibco公司)、胎牛血清(FBS，杭州四季青生物技術有限公司)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，Pepro Tech公司)、表皮細胞生長因子(EGF，Sigma公司)、EPO(武漢原生原代生物醫藥科技有限公司)，四甲基偶氮唑藍(MTT)及二甲基亞砜 (DMSO，Sigma)，Anti-Nestin兔抗多克隆抗體及Anti-EPO兔抗多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 NSC分離培養及單細胞克隆的制作 實驗大鼠均為吉林大學實驗動物中心提供，37℃環境中，無菌條件下取出孕齡11.5天大鼠的胎鼠腦組織剪碎，加入0.25%胰蛋白酶消化10 min，過濾采用120目銅網，去除組織纖維，加入濃度為20 ng/ml的EGF以及20 ng/ml的bFGF組成的生長培養基，離心后去除上清液以獲取單個細胞懸液，活細胞密度調整至1.0×105/ml，接種于培養瓶中，第1次換液于24 h，以后每2日換液1次，培養5～6 d，克隆形成后制成單細胞懸液，以細胞密度為1.0×105/ml進行傳代，以此方法傳代3次即傳至P3，P3代液體離心后取NSC。

1.2.2 NSC的鑒定 選用P3代單細胞克隆球進行Nestin免疫細胞化學染色，結果顯示Nestin表達呈陽性，神經細胞球內細胞質均呈棕褐色;誘導分化后分別進行神經元特異性烯醇化酶(NSE)及膠質纖維醇性蛋白(GFAP)免疫細胞化學染色，NSE表達陽性。GFAP免疫細胞化學染色見細胞質及突起呈棕褐色，胞體較大、突起粗而短。

1.2.3 實驗方法 在三氣培養箱中，實驗環境分別設置為常氧環境及低氧環境，溫度均為37℃，培養120 h。通過調節N2濃度而設定O2的濃度為5%，選用P3代克隆干細胞單細胞懸液，實驗組將NSC接種于含 EPO的濃度為50 U/ml的培養基中，同時設含等量的NSC且不含EPO的對照組。每日觀察NSC的分化情況。

1.2.4 檢測方法

1.2.4.1 MTT法檢測 以每孔約1.0×104個細胞密度接種于96孔培養板中，100 μl/孔。于37℃、5%CO2孵箱中培養過夜。待細胞貼壁后棄上清液。取10 μl溶于磷酸鹽緩沖液(PBS)的MTT(5 mg/ml)加入每孔，然后在37℃孵箱中孵育4 h，將孔內溶液棄掉，加入DMSO每孔100 μl，輕輕震蕩10 min以終止反應并充分溶解甲臜顆粒。用酶標儀570 nm處測吸光度(OD)值。實驗重復3次，每次實驗中相同條件設6個平行孔。

1.2.4.2 免疫熒光染色及計數 將干預后的細胞分別接種于6孔培養板中，每孔接種50個神經球，常規處理后，分別做NSE、GFAP免疫熒光染色，倒置熒光顯微鏡普通光路及488 nm波長光路下計數每個視野下的細胞總數和陽性細胞數，求出陽性細胞數的百分率，取平均值。

1.3 統計學分析 應用SPSS10.1統計軟件進行處理，數據資料以±s表示，組間比較用t檢驗。

2 結果

各組細胞經過5 d培養，常氧組、對照組、實驗組的細胞克隆形成率(%)分別為 30.37±4.34、42.82±5.25、70.14±5.52，實驗組明顯高于對照組(P＜0.01)。常氧組、對照組、實驗組的 NSC的分化比率(%)分別為32.5±4.2、47.2±5.1、72.8±5.8，對照組與實驗組比較有顯著性差異(P＜0.05)。

3 討論

EPO 是一種含唾液酸的酸性熱穩定糖蛋白，近年來國內外學者研究表明EPO及其受體廣泛存在于人和動物體內多種組織和器官中。EPO與神經系統的生長、發育密切相關，尤其是對發育中的中樞神經系統具有保護作用，并可提高神經的再生與修復〔1〕。EPO可促進腦組織在缺氧狀態下血管內皮細胞的分化，因而可改善缺血部位的供血及營養的供應，NSC與缺氧的程度成正比，缺氧劑量越高，凋亡細胞的數量越多〔2〕。EPO還可作為神經分化因子，影響神經細胞的分化及再生，并可促進NSC分化為多巴胺能神經〔3〕。本研究取鼠胚腦源性神經細胞進行傳代克隆，在低氧環境中分別設立實驗組及對照組，實驗組接種于含EPO的培養基中，對照組與實驗組的細胞克隆形成率(%)分別為42.82±5.25、70.14±5.52，實驗組明顯高于對照組(P＜0.01)，表明EPO對低氧環境中的NSC有促進分化及抑制凋亡的作用。國內學者趙保明等〔4〕的實驗結果支持了本結論。本實驗的分化培養中，實驗組顯示神經球貼壁較快，周圍伸出突起早，培養24 h左右觀察到細胞從神經球中遷出，2 d后見突起互相交織，3 d后即形成密集的網絡樣結構。P3代神經球Nestin實驗呈陽性反應，誘導分化后部分神經干細胞NSE實驗陽性，部分GFAP實驗陽性，說明培養出來的NSC有分化為神經元和星型膠質細胞的能力。經免疫熒光染色及計數方法測得實驗組中的 NSE陽性細胞數最多，高于常氧組及對照組(P＜0.05)。EPO直接作用于大鼠的鼠胚內皮細胞，使其分泌腦源性神經營養因子，該物質可以促進NSC的增殖和分化〔5〕。EPO與EPO受體結合后，改變后者的構象，激活了蛋白酪氨酸激酶，使神經細胞內多種蛋白質酪氨酸磷酸化，啟動信號轉導通路，從而控制 NSC的增殖和分化，抑制其凋亡〔6，7〕。實驗中的bFGF和EGF作為重要的有絲分裂原，在機體細胞的生長、發育以及受損組織的修復過程中起到重要的作用，二者對培養基中的NSC的生長具有很強的促進作用。Eisen等〔8〕認為，EPO不僅對NSC的缺氧性損傷有保護作用，對于其他形式的傷害同樣也具有保護作用。

總之，EPO作為新的神經營養因子，對缺氧的胚鼠腦源性NSC有營養和保護作用，刺激神經祖細胞的分化及增殖，阻止其凋亡，為EPO治療人類中樞神經系統損傷和退行性變提供了新的實驗基礎。

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2 Maiese K，Li F，Chong ZZ.Erythropoietin in the brain:can the promise to protect be fulfilled〔J〕.Trends Pharmacol Sci，2004;25(11):577-83.

3 Park MH，Lee SM，Lee JW，et al.ERK-mediated production of neurotrophic factors by astrocytes promotes neuronal stem cell differentiation by erythropoietin〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2006;339(4):1021-8.

4 趙保明，趙 莉，耿慧慧.促紅細胞生成素對低氧狀態下神經干細胞增殖、分化的影響〔J〕.蚌埠醫學院學報，2010;35(1):4-9.

5 Wang L，Zhang Z，Wang Y，et al.Treatment of stroke with erythropoietin enhances neurogenesis and angiogenesis and improves neurological function in rats〔J〕.Stroke，2004;35(7):1732-7.

6 Chang YC，Huang CC.Perinatal brain injury and regulation of transcription〔J〕.Curr Opin Neurol，2006;19:141-7.

7 Zhao W，Kitidis C，Fleming MD，et al.Erythropoietin stimulates phospho-rylation and activation of GATA-1 via the PI3-kinase/AKT signaling pathway〔J〕.Blood，2006;107(3):907-15.

8 Eisen A，Fisman EZ，Rubenfire M，et al.Ischemic preconditioning:nearly two decades of research.A comprehensive review〔J〕.Atherosclerosis，2004;172(2):201-10.