呼腸孤病毒Ⅲ型免疫熒光檢測方法的建立及初步應用

王 吉，衛 禮，岳秉飛，賀爭鳴

（中國藥品生物制品檢定所、國家實驗動物質量檢測中心，北京 100050）

呼腸孤病毒Ⅲ型（Reo3）屬呼腸孤病毒科的正呼腸孤病毒屬。此種病毒可感染所有哺乳動物，包括小鼠、地鼠、豚鼠、貓和犬等［1-2］。并且能在人、猴、豚鼠、地鼠、貓、狗、豬和牛的原代腎細胞以及Hela、KB、FL和L細胞等傳代細胞中增殖并引起細胞病變。Reo3也能感染人，能引起兒童腹瀉、呼吸道感染及腦膜炎等疾病［2-4］。由于上述動物和細胞存在Reo3的自然感染，而用上述動物原材料或細胞而生產的人用生物制品也可能存在Reo3的潛在污染，對人用動物原材料及動物源性生物制品的使用安全性造成潛在威脅［5］。

因此建立Reo3免疫熒光（IFA）檢測方法，開展對人用動物原材料及動物源性生物制品外源Reo3的檢測，保證生物原材料及制品的使用安全性至關重要。本文旨在建立簡單、快速、特異、敏感的免疫熒光檢測方法，對人用動物源性生物材料及其制品進行Reo3檢測。

1 材料和方法

1.1 主要材料

Reo3毒種、BSC-1細胞、BHK21細胞：本室凍存；免疫熒光素（山羊抗小鼠IgG-FITC）：KPL公司產品；SPF BALB/c小鼠，中國藥品生物制品檢定所實驗動物資源中心生產（許可證號：SCXK（京）2009-0017）；小鼠抗Reo3血清及小鼠陰性血清：本室制備；乙型腦炎減毒活疫苗：本所疫苗一室提供。

1.2 主要儀器

熒光顯微鏡：Olympus IX；37℃水浴箱：上海森信實驗儀器有限公司DK-4500B型；37℃培養箱：WGP-600；多孔熒光片：Thermo公司產品。

1.3 方法

1.3.1 敏感細胞的篩選和病毒感染力滴度（TCID50）測定：選擇BHK21細胞和BSC-1細胞分別接種Reo3毒種，每天觀察細胞病變（CPE）。待細胞50％～80％發生圓縮病變后，收凍。分別將第3代BHK21細胞毒和BSC-1細胞毒以10-1～10-11作系列倍比稀釋，依次加入培養有BHK21細胞和BSC-1細胞的96孔細胞培養板（costor）（1～11列），每個稀釋度接種1列（8孔），第12列不加病毒，作為細胞對照。置37℃培養觀察10d，記錄結果［6］。

1.3.2 Reo3陽性血清與陰性血清的制備：

1.3.2.1 免疫抗原的制備與純化：收獲Reo3細胞毒于4℃，10 000r/min離心1h，取上清液于4℃，40 000r/min離心3h，收集沉淀于適量PBS中。再經20％蔗糖離心后，用紫外分光光度法測定抗原蛋白含量。然后用PBS稀釋至1mg/mL，分裝后凍存于-70℃備用。

1.3.2.2 免疫接種方法及程序：（1）第一次免疫：取0.3mL純化Reo3抗原與0.9mL弗氏完全佐劑混勻，腹腔注射6只SPF KM小鼠，每只注射0.2mL。（2）第二次免疫：在第一次免疫后第14天，取0.3mL純化Reo3抗原與0.9mL弗氏完全佐劑混勻，腹腔注射每只小鼠0.2mL，同時每只腹腔注射0.5mL液體石蠟。（3）第三次免疫：在第一次免疫后第21天，取0.3mL純化后Reo3抗原，加入0.9mL弗氏完全佐劑中，混勻后腹腔注射每只小鼠0.2mL。

1.3.2.3 抗體的檢測：第一次免疫后第35天開始收集腹水，每次收集后2 000r/min離心10min，上清液56℃滅活30min，凍存于-70℃備用，收集的腹水用本室ELISA法測其效價，留取A490＞1.0的腹水混合后分裝至1.5mL離心管中凍存于-70℃作為陽性對照備用。

1.3.2.4 陰性對照血清制備：分離的SPF小鼠血清，經Reo3 ELISA檢測為陰性的樣品，56℃滅活30min，用本室ELISA法測其效價＜0.1，分裝至1.5mL離心管中凍存于-70℃作為陰性對照備用。

1.3.3 抗原片的滴定：接種Reo3的敏感細胞，病變達70％～80％，滴片，同時設正常細胞對照。冷丙酮固定，置-20℃凍存備用［7］。

1.3.4 操作和判斷標準的確定：依據《中華人民共和國藥典》2010版三部和國標進行實驗和結果判定。在陰、陽對照成立的情況下，待檢血清與正常細胞反應無熒光，與感染細胞反應有熒光判為陽性［7-8］。

1.3.5 免疫熒光素最佳工作濃度的確定：小鼠Reo3陽性血清及陰性血清分別以1：10稀釋［7］，羊抗小鼠IgG-FITC以1：50～1：3200進行系列倍比稀釋，滴定熒光抗體最佳工作濃度。以出現“++++”的熒光抗體最大稀釋比例為其最佳工作濃度。

1.3.6 敏感性試驗：將小鼠陽性血清從1：10～1：5120進行系列倍比稀釋進行檢測，以出現“++”的最大稀釋比例為其檢測靈敏度；將Reo3細胞毒以10-1～10-11作系列倍比稀釋，分別接種BSC-1細胞，48h后分別滴片，與陽性血清進行免疫熒光反應，以檢測到出現“++”的病毒感染滴度來確定檢測方法的敏感性。

1.3.7 特異性試驗：用建立的IFA法分別檢測小鼠鼠痘（Ect）病毒和小鼠肝炎病毒（MHV）陽性血清，同時設標準陰、陽對照。用小鼠Reo3陽性血清和陰性血清與小鼠鼠痘（Ect）病毒感染BHK21細胞片進行交叉免疫熒光試驗；同時與正常BSC-1細胞和Reo3感染BSC-1細胞進行玻片免疫熒光試驗。

1.3.8 穩定性試驗：將3個不同批次抗原片同時對小鼠陽性血清從1：10～1：5120進行檢測；同1批次抗原片于-20℃保存1個月、3個月和6個月3個不同時間，分別對小鼠陽性血清從1：10～1：5120進行檢測，觀察其檢測結果是否一致。

1.3.9 初步應用：

1.3.9.1 動物抗體的檢測：用建立的IFA方法對2008年～2010年國內7個廠家送檢60份小鼠血清進行抗體檢測，并記錄結果。

1.3.9.2 Reo3抗原的檢測：利用細胞試驗和IFA法對人用動物源性材料及生物制品進行檢測。

（1）以國內3個公司生產的9批次乙腦減毒活疫苗為樣品進行檢測。每批次疫苗接種BSC-1細胞2瓶。同時設細胞對照2瓶，Reo3毒種2瓶。37℃吸附1.5 h，棄掉吸附的檢品液體，加入細胞維持液，每d觀察細胞形態，每3～4d換液一次，并記錄結果。

（2）9批次疫苗接種BSC-1細胞，盲傳3代。每代細胞進行滴片，分別與1∶10的陰、陽血清進行免疫熒光反應。同時用已知病毒抗原片作陽性和陰性對照。

（3）選擇2010年國內6個不同廠家送檢的鼠源性單克隆抗體細胞株10批次，分別接種BSC-1細胞，同時設細胞對照2瓶，Reo3毒種2瓶。每天觀察細胞病變情況，并記錄結果。盲傳2代后的細胞滴片，分別與小鼠陰、陽血清進行免疫熒光反應［8］。

2 結果

2.1 敏感細胞的篩選

BHK21細胞和BSC-1細胞接種Reo3 48h后，均有70％～90％細胞出現CPE，病毒感染力滴度分別為10-5.3/mL和10-5.8/mL。選擇BSC-1細胞為Reo3培養細胞。

2.2 Reo3陽性血清與陰性血清的制備

制備免疫用抗原測蛋白濃度為5.1mg/mL。制備陽性對照（免疫血清及腹水A＞1.0）共15.0mL。制備陰性對照血清12.7mL。

2.3 羊抗小鼠IgG-FITC最佳工作濃度的確定（表1）。

滴定結果顯示當FITC為1∶100時正常細胞孔與陰、陽對照血清反應均無綠色熒光，也未觀察到熒光背景干擾；Reo3感染細胞孔與陰性對照血清反應無綠色熒光，與陽性對照血清反應產生強綠色熒光（圖1、2見封二）。

2.4 敏感性試驗

抗體檢測最大稀釋比例為1：1280；檢測病毒滴度最低為10-4.7/mL。

2.5 特異性試驗

用已建立IFA法檢測小鼠鼠痘（Ect）病毒、和小鼠肝炎（MHV）病毒陽性血清，結果均為陰性。Reo3陰性對照和陽性對照與小鼠鼠痘（Ect）病毒感染的BHK21細胞均無交叉免疫熒光反應。

2.6 穩定性試驗

3個不同批次抗原片同時對小鼠陰、陽性血清從1：10～1：5120進行檢測，和同1批次抗原片于-20℃保存1個月、3個月、6個月三個不同時間對小鼠陽性血清從1：10～1：5120進行檢測，檢測結果均一致，檢測靈敏度均為1：1280。

2.7 應用

2.7.1 動物抗體的檢測：IFA法檢測60份小鼠血清，有4份抗體陽性，56份抗體陰性。

表1 熒光素工作濃度滴定結果Tab.1 Titration results of the IgG-FITC

2.7.2 細胞接種和免疫熒光試驗：（1）細胞接種試驗顯示，2瓶BSC-1細胞對照連續觀察無CPE產生（圖3），Reo3毒種使BSC-1細胞發生明顯CPE，（圖4）；9批次樣品接種的3代BSC-1細胞均未發生CPE，檢測結果均為陰性（圖3，4見封二）。（2）在陰陽對照成立的情況下，9批次樣品接種3代BSC-1細胞涂片與小鼠陰性血清及陽性血清均無綠色熒光反應，檢測結果均為陰性。（3）細胞接種試驗顯示在正常細胞對照成立的情況下，10批次鼠源性單克隆抗體細胞株接種BSC-1細胞，均無CPE產生；免疫熒光試驗顯示，在陰、陽對照成立的情況下，10批次單克隆抗體細胞株接種BSC-1細胞涂片與小鼠陰性血清及陽性血清均無綠色熒光反應，結果均為陰性。

3 討論

敏感性試驗顯示抗體檢測最大稀釋比例為1∶1280；檢測病毒滴度最低為10-4.7/mL；特異性試驗顯示與小鼠易感的其他病毒無交叉反應；穩定性試驗顯示不同批間和批內重復性試驗檢測靈敏度一致，均為1∶1280。說明本試驗建立IFA法敏感性、穩定性好，特異性強。

本實驗BSC-1細胞感染Reo3后，細胞內顆粒增多、細胞腫大、脫落、折光度增加，與Reo3的致細胞病變效應一致（圖4），且Reo3陽性血清的檢測結果為細胞內出現強綠色熒光反應，為IFA檢測中抗原抗體相結合的陽性表現（圖2）；Reo3陰性血清的IFA檢測結果為紅色細胞，未見綠色熒光，為典型的IFA檢測陰性表現（圖1）；說明所建立的Reo3的IFA法效果較好［10］。

本試驗同時用本室建立的ELISA法對上述IFA檢測的60份小鼠血清進行Reo3抗體檢測。結果顯示IFA法檢測抗體陽性的4份血清用ELISA法檢測，結果均為陽性；IFA法檢測抗體陰性的56份血清用ELISA法檢測，結果均為陰性，2種方法檢測符合率為100％。

用細胞接種和免疫熒光試驗相結合檢測9批次乙腦減毒活疫苗，3代BSC-1細胞均未發生CPE，3代細胞滴片分別與Reo3陰、陽對照血進行免疫熒光反應，均為陰性。說明9批次疫苗均未被Reo3活毒感染。保證了疫苗使用的安全性。

同時用建立的IFA法檢測了2010年國內6個廠家送檢的鼠源性單抗細胞株10批次，結果顯示均為陰性。與本室做的動物安全試驗、動物抗體產生試驗、雞胚接種和血凝試驗檢測結果一致，也說明了檢測結果的準確性和可靠性。

本試驗通過篩選，確定了Reo3敏感細胞，并滴了抗原片，為以后建立如大鼠、地鼠、等其他動物Reo3 IFA檢測方法的建立奠定了基礎。

本試驗建立IFA法具有操作簡便、快速、敏感、特異等特點［11］，利用細胞接種和免疫熒光相結合的檢測方法具有穩定性好、檢測結果可靠等特點，可應用于動物源性生物材料及生物制品外源Reo3的檢測。

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