動態分析沙鼠非酒精性脂肪肝病形成及生化影響

李 巍，石巧娟，郭紅剛，樓 琦，盧領群，薩曉嬰

（浙江省醫學科學院，浙江省實驗動物中心，杭州 310013）

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是一種無過量飲酒史，以肝實質細胞脂肪蓄積和脂肪變性為特征的臨床病理綜合癥，包括單純性脂肪肝以及由其演變的脂肪性肝炎、肝纖維化和肝硬化。近年來，隨著人類生活水平的提高和飲食結構的變化，NAFLD的發病率呈逐年上升趨勢，且發病呈低齡化。然而，由于NAFLD病因復雜，確切致病機理至今仍尚未形成定論，對NAFLD的預防、診斷、治療策略也很有限。有關脂肪肝的病因學、預防和治療的研究具有極其重要的意義，并已經成為研究熱點。越來越多的證據表明，部分NAFLD并不是一種良性的、靜止的病變，它可在較短期內發展為不可逆的肝損害，其肝纖維化的發生率高達25％，其中約1.5～8.0％的患者可進一步發展為肝硬化［1，2］。研究非酒精脂肪肝發展過程是澄清脂肪肝發病機理，開發藥物和發展針對性預防和治療方案的關鍵所在。

動物模型是研究人類疾病的重要手段，現有的單純高質飲食誘導的NAFLD動物模型與人類疾病的病因、病機及病程發展都存在一定的差別，對模型動物在不同的造模時間所處的組織病理及相關生理生化變化鮮有報道。脂肪肝被認為是代謝綜合征在肝臟的表現形式，而長爪沙鼠是研究代謝綜合征比較理想的實驗動物，目前已建立了長爪沙鼠高膽固醇血癥、Ⅱ型糖尿病模型及肥胖等代謝綜合征模型［3-6］。長爪沙鼠的脂代謝有許多特點與人類脂代謝相似［7，8］，同時由于其個體小，易于實驗的管理和操作，是一個良好的研究脂代謝方面的動物。本研究以單純高脂飲食建立沙鼠NAFLD模型，通過動態分析肝臟病理變化，檢測同時期肝組織游離脂肪酸含量、脂質代謝、肝功能、抗氧化等指標，探討沙鼠NAFLD形成及發展的機理，為研究NAFLD的發病發展機制和治療靶點選擇提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑：蛋黃粉為浙江省長興縣艾格生物制品有限公司產品。膽固醇、三號膽鹽購于華東醫藥股份有限公司。食用豬油購于超市。天冬氨酸氨基轉移酶（GOT）、丙氨酸氨基轉氨酶（GPT）、膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白（HDL-c）和低密度脂蛋白（LDL-c）診斷試劑盒均購自上海豐匯醫學科技有限公司。總蛋白定量測試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、谷胱甘肽-過氧化物酶（GSH-PX）測試盒、過氧化氫酶（CAT）測試盒和游離脂肪酸（FFA）測試盒均購自南京建成生物工程研究所，并由南京建成生物工程研究所完成盲樣檢測。

1.1.2 實驗儀器：意大利Autolab全自動生化分析儀PM4000，日本Olympus生物顯微鏡SZX7、美國Media Cybernetics公司多功能真彩色細胞圖象分析管理系統，德國萊卡切片機，低溫高速臺式離心機TGLY6G。

1.1.3 實驗動物：（50±10）g雄性長爪沙鼠120只，由浙江省醫學科學院實驗動物中心提供（生產許可證號：SCXK（浙）2008-0034；使用許可證號：SYXK（浙）2008-0114）。

1.1.4 飼料配方：普通飼料及高脂飼料由浙江省醫學科學院實驗動物中心加工生產。高脂飼料配方為：普通飼料80.5％、蛋黃粉10％、豬油7％、膽固醇2％、三號膽鹽0.5％［9-12］。

1.2 方法

1.2.1 模型建立：實驗動物適應性飼養1周后，按體重隨機分為對照組與模型組，每組60只。對照組給予普通飼料作為陰性對照，模型組給予高脂飼料建立NAFLD模型。于對比飼養第1、2、4、6、8、16周末，隨機抽選模型組與對照組各10只沙鼠，進行標本采集及相應的指標測定。

1.2.2 標本采集及指標測定：動物稱重后用1％戊巴比妥鈉麻醉，腹主動脈采血方式致死。分離血清，測定CHO、TG、HDL-c、LDL-c、GOT及GPT的含量。取肝臟稱重，以臟器重量/體重×100％計算臟器指數。將取自肝最大葉中部組織用4％甲醛固定并制備石蠟切片，進行HE染色和Mallory三色染色后，用光學顯微鏡觀察病理變化。另切0.5g肝右葉，勻漿后，測定SOD、GSH-px、CAT、FFA的含量。

1.2.3 統計學方法：計量資料以均值±標準差表示，采用SPSS11.5統計分析軟件分析。各組間比較采用兩樣本均數的T檢驗。

2 結果

2.1 肝臟病理學分析

2.1.1 外觀特征：對照組沙鼠肝臟均柔潤，暗紅色，有光澤（圖1 A）。模型組（圖1 B～G）隨飼喂時間延長，肝臟色澤逐漸由暗紅變成赭色（2周）、土褐色（6周）和奶黃色（16周）；肝臟邊緣由尖銳逐漸變為圓鈍，包膜越來越緊張，腫脹程度逐步加劇。這表明，模型組沙鼠脂肪肝程度隨時間加劇。

圖1 隨高脂飼喂時間的延長沙鼠的肝臟外觀變化（圖中由A到G依次為對照組，1，2，4，6，8，16周）Fig.1 Gross appearance of the livers at different time points（A to G：control，1，2，4，6，8，16 weeks）

2.1.2 光鏡觀察：HE染色和Mallory三色染色顯示，對照組肝組織結構正常，肝竇清晰可見，肝索排列整齊，小葉結構及匯管區均未見異常，細胞完整（圖2）。模型組1、2、4、6、8、16周所有動物肝組織均出現不同程度的肝細胞脂肪變性，而且，NAFLD進展程度與高脂飲食時間正相關。具體來講，1周時肝組織約10％～30％的肝細胞發生脂肪變性（圖3），肝索結構尚存；2周約30％～40％肝細胞脂肪變性，肝索結構排列紊亂（圖4），形成單純性脂肪肝模型；4周時約40％～60％肝細胞脂肪變性，模型動物單純性脂肪肝進一步加劇（圖5）；6周時60％～80％肝細胞脂肪變性，肝細胞排列混亂，部分動物門管區有炎癥（圖6），形成脂肪性肝炎模型；8周肝細胞體積增大，胞質疏松淡染，肝細胞內充滿細小泡沫樣脂滴空泡，腺泡Ⅲ帶局灶性竇周/細胞周纖維化（圖7）；16周時，75％～90％肝細胞脂肪變性，腺泡Ⅲ帶肝細胞內充滿大小不一、形態各異的脂滴空泡，（圖8），局灶性或廣泛的中度橋接纖維化（圖9），形成脂肪性肝纖維化模型（圖2～9見彩插2）。

2.2 肝功能及肝指數指標分析

由圖10可知，1周末，模型組沙鼠肝指數已高于對照組（P＜0.05），在1～16周模型組沙鼠肝指數表現出進行性增長趨勢，16周時模型組肝指數達到對照組的2倍以上。由表1可知8周末，GOT、GPT出現了升高但無顯著性；16周末，GOT、GPT出現了顯著性升高（P＜0.01）。數據說明，8周末開始模型組動物出現肝細胞破損。

圖10 沙鼠肝指數的變化（n=10）Fig.10 Changes of liver index of the gerbils（n=10）

表1 沙鼠血清GOP及GTP肝指數的變化Tab.1 Changes of serum GOT and GPT levels and liver indexes of the gerbils（n=10）

表2 沙鼠血清CHO、TG、LDL-C和HDL-C的變化Tab.2 Changes of serum CHO，TG，LDL-C，HDL-C levels of the gerbils（n=10）

2.3 血脂分析（CHO、TG、LDL-C、HDL-C）

由表2可知，與同期對照組相比，模型組沙鼠1周末血清CHO、TG、LDL-C、HDL-C均已有顯著性升高（P＜0.05，P＜0.01），6周時血脂水平有所回落；除TG外，其余三項在8周時均有所回升，持續升高到16周末。此數據表明沙鼠在不同階段出現了不同程度的血脂紊亂。模型組沙鼠HDL-C雖有顯著性升高，但各階段HDL-C/CHO比值均低于對照組，表明沙鼠血漿中的膽固醇轉運與人類相同，即更多的依賴于低密度脂蛋白。

2.4 肝游離脂肪酸含量分析

由表3可知，與同期對照組相比，模型組1周后肝組織FFA含量即出現了顯著升高（P＜0.01），6周時有所回落，8周時回升持續升高到16周末。表明了沙鼠在高脂飲食1周后肝內即有過量的FFA堆積。

表3 沙鼠肝組織FFA含量的變化Tab.3 Changes of FFA content in liver tissue of the gerbils（n=10）

2.5 抗氧化相關酶類活性分析

由表4可知，1-4周末模型組CAT活性有顯著性降低（P＜0.01）；8-16周末GSH-px活性有顯著性降低（P＜0.01）；4、16周末SOD活性有降低（P＜0.01），但未出現持續性的變化。16周末，抗氧化酶活性（SOD、GHS-PX、CAT）活性都顯著性降低（P＜0.01），GSH-px、CAT活性為對照組酶活性的1/2。不同抗氧化酶在不同時期表現出的顯著性降低可能與沙鼠NAFLD模型病情的發展相關。

3 討論

人類疾病動物模型是醫學研究中建立的具有人類疾病表現的動物模型。人類疾病的發生發展是十分復雜的，應用人類疾病動物模型，可克服復雜因素，并增加方法學上的可比性，有利于更全面地認識疾病的本質。人類疾病動物模型的設計應遵循相似性、重復性、可靠性、適用性和可控性、易行性和經濟性等原則，已有的NAFLD動物模型尚無法滿足上述的設計原則。目前，NAFLD模型可以分為先天性/誘導遺傳突變遺傳性脂肪肝和通過理化因素處理而產生的獲得性脂肪肝兩大類。相比而言，高脂飲食法可克服其他方法存在的或費用昂貴，或材料耗費多、穩定性差、成功率欠高、對動物損傷過重或死亡率過高等弊端，最重要的是高脂飲食法更符合人類膳食習慣與自然發病規律。高脂飲食法NAFLD動物模型最常用的實驗動物為大鼠，但該模型造模時間較長，TG血癥難以出現或不穩定。臨床上NAFLD隨病情的進展可表現為單純性脂肪肝病、非酒精性脂肪肝炎、脂肪性肝纖維化和脂肪性肝硬化4個階段，而大鼠NAFLD模型停滯在脂肪性肝炎模型階段，進一步發展為肝纖維化模型則需要輔以酒精［13，14］，與人類NAFLD病程不符。目前尚缺乏滿足人類疾病動物模型設計原則的NAFLD動物模型。本研究以長爪沙鼠為實驗動物復制人類NAFLD模型。該模型除滿足重復性、可靠性、適用性和可控性、易行性和經濟性等人類疾病動物模型的設計原則外，最大的優點在于該模型發病條件及病程進展表現出與人類NAFLD的相似性，在以符合人類膳食習慣與自然發病規律相似的單純性高質飲食條件的誘導下，2周后形成穩定的脂肪肝模型，隨著飼喂時間的延長，脂質蓄積不斷加劇，中期出現炎癥灶，中后期發展為脂肪性肝纖維化（部分動物肝臟出現硬化），彌補了其他實驗動物無法以單純的高脂飲食法復制肝纖維化模型的缺陷。

表4 沙鼠肝組織SOD，GSH-PX，CAT活性的變化Tab.4 Changes of SOD，GSH-PX and CAT enzyme activity in liver tissue of the gerbils（n=10）

綜合沙鼠NAFLD模型在不同的造模時間所處的肝臟病理變化及肝組織游離脂肪酸含量、脂質代謝、肝功能、抗氧化等指標的結果分析，我們發現脂質代謝紊亂與氧化應激在沙鼠NAFLD模型病程進展中的發揮了不同的作用。流行病學顯示，高脂血癥為脂肪肝的重要危險因素，關系最為密切的為高TG血癥。而過量的游離脂肪酸（外源性或內源性），特別是不飽和FFA，在肝內積聚是NASH的發病激發因素［15］。飼喂高脂飼料1周后，沙鼠出現了持續的血脂升高，肝組織FFA含量顯著性增加，推測這些變化都與肝內脂質蓄積的發生發展緊密相關。另一方面，肝內FFA水平的升高為也為活性氧的大量產生提供了來源。現代研究表明，活性氧增多和活性氧清除劑減少是NASH的重要發病機制［16］。機體活性氧清除劑主要包括超氧化物歧化酶（SOD）等酶類和谷胱甘肽（GSH）等非酶類活性氧清除劑。活性氧增多和活性氧清除劑減少引起氧化應激，而氧化應激是引起單純的脂肪變性向脂肪性肝炎和肝硬化進展的主要原因［17］。推測由于模型組沙鼠肝內FFA水平持續升高導致大量活性氧的生成，CAT、SOD、GSH-PX酶活性在不同階段內的顯著性降低，致使機體發生氧化應激，從而使得模型組沙鼠6周時肝臟出現了炎癥灶，8周時肝細胞破損，至16周末，在脂質代謝紊亂與氧化應激持續綜合作用下，動物形成中度脂肪性肝纖維化。

實驗還發現，在脂質代謝方面，6周時模型的血脂與FFA同時有所回落，除TG外，在8周時都再次升高，推測6周沙鼠對高脂飲食做出了應激性調整。沙鼠在實驗前期1～4周內有穩定的高TG血癥，且沙鼠血漿中的膽固醇轉運與人類相同，即更多的依賴于低密度脂蛋白。因此，在高脂血癥模型動物的選擇中沙鼠也有很大的優勢。

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