糖皮質(zhì)激素對(duì)機(jī)械通氣大鼠肺組織iNOS、NO表達(dá)的影響

劉 芳，張新日，張 巖

（山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院呼吸科，太原 030001）

呼吸機(jī)所致肺損傷（ventilator induced lung injury，VILI）是影響機(jī)械通氣臨床療效的一個(gè)重要因素，研究VILI的發(fā)生機(jī)制和防治措施對(duì)提高機(jī)械通氣的應(yīng)用水平以及危重癥患者的救治水平均具有重要意義［1］。本研究擬通過(guò)動(dòng)物試驗(yàn)，探討糖皮質(zhì)激素對(duì)大潮氣量機(jī)械通氣大鼠肺組織誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）及一氧化氮（NO）表達(dá)的干預(yù)作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組與模型制備

雄性健康Wistar大鼠24只（山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供）［SCXK（晉）2009-001］，體重310～380g，隨機(jī)分為3組①對(duì)照組：未行機(jī)械通氣；②機(jī)械通氣組：VT=40mL/kg；③地塞米松干預(yù)組：VT=40mL/kg，通氣前1h經(jīng)腹腔注入DXM（6mg/kg）。

用25％烏拉坦4mL/kg腹腔注射將大鼠麻醉后行氣管切開(kāi)。除對(duì)照組外，其余大鼠均通過(guò)膠管與動(dòng)物人工呼吸機(jī)（DH-150型，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠制造）連接，進(jìn)行機(jī)械通氣。各組大鼠的通氣參數(shù)除潮氣量外，其余參數(shù)均相同，即I∶E=1∶3，F(xiàn)iO2=21％，F(xiàn)=60次/min，通氣時(shí)間為90min。

通氣結(jié)束后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血2～3mL，肝素鈉抗凝，離心取上清液置于EP管中，-80℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ缓髮⒋笫蠓叛幩溃腥》闻K。在無(wú)菌狀態(tài)下取右肺上葉置于已消毒的EP管中，-80℃冰箱保存，用于RT-PCR及肺組織NO測(cè)定。取右肺下葉以10％中性福爾馬林灌注固定，24h后行常規(guī)石蠟包埋，用于HE及免疫組織化學(xué)染色。

1.2 RT-PCR法檢測(cè)肺組織iNOSmRNA的表達(dá)

用Trizol（TaKaRa寶生物工程有限）提取肺組織總RNA，以大鼠GAPDH（磷酸甘油醛脫氫酶）作為內(nèi)參。大鼠iNOS及內(nèi)參引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。大鼠iNOS及內(nèi)參（GAPDH）引物由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。iNOS上游引物：5’-GGC TCC AGC ATG TAC CCT-3’；下游引物：5’-TCC TGC CCG CTG AGT TCG T-3’；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，55℃復(fù)性30s，70℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后70℃延伸2min。GAPDH上游引物：5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’；下游引物：5’-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA-3’；反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4min，95℃變性30s，59℃復(fù)性30s，70℃延伸30s，30個(gè)循環(huán)，最后70℃延伸5min。取PCR產(chǎn)物在2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，用天能2500凝膠圖像分析系統(tǒng)掃描條帶密度，以目的基因光密度值與內(nèi)參光密度值的比值表示肺組織iNOS mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 肺組織iNOS免疫組織化學(xué)染色

采用鏈霉素親和-生物素-過(guò)氧化酶復(fù)合物（SABC）法檢測(cè)大鼠肺組織iNOS蛋白表達(dá)。操作步驟按試劑盒說(shuō)明（購(gòu)自武漢博士德生物有限公司）進(jìn)行。兔抗大鼠抗體工作濃度為1∶50，以PBS（磷酸鹽緩沖液）代替一抗作陰性對(duì)照。

結(jié)果判斷：陽(yáng)性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色，陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞多集中于細(xì)支氣管上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞。采用MIAS-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)每個(gè)高倍視野（40×10）的目標(biāo)平均灰度（GO）、視場(chǎng)平均灰度（GV）和面積密度（AAR），并計(jì)算出陽(yáng)性單位，即PU=［∣GO-GV︱×100］/［（1-AAR）×Gmax］，其中Gmax為最大灰度（255）［1］。

1.4 肺組織和血漿NO測(cè)定

采用硝酸還原酶法測(cè)定肺組織和血漿NO含量，方法及操作步驟按試劑盒（購(gòu)自南京建成生物工程研究所）說(shuō)明進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 肺組織iNOS mRNA及其蛋白表達(dá)

各組大鼠肺組織iNOS mRNA及其蛋白表達(dá)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1和圖1～5。結(jié)果顯示，機(jī)械通氣組和DXM干預(yù)組肺組織iNOS mRNA及其蛋白表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），而DXM干預(yù)組肺組織iNOS mRNA及其蛋白表達(dá)水平較機(jī)械通氣組明顯降低（P＜0.01）。

表1 各組大鼠肺組織iNOSmRNA及其蛋白表達(dá)Tab.1 The expression of iNOS mRNA and proteinum in lung in groups

圖1 各組大鼠肺組織iNOS mRNA表達(dá)（RT-PCR）Fig.1 The expression of iNOS mRNA in lung tissue in groups（RT-PCR）

圖2 機(jī)械通氣組大鼠肺組織彌漫性肺間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)Fig.2 Different levels of interstitial and alveolar edema，infiltration and activation of inflammation cells could be seen in ventilation group

圖3 對(duì)照組大鼠肺組織iNOS蛋白（SABC）Fig.3 iNOS protein in lung tissue in control group（SABC）

2.2 血漿和肺組織NO測(cè)定

各組大鼠血漿和肺組織NO含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示：機(jī)械通氣組和DEX干預(yù)組血漿和肺組織NO含量均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），而DXM干預(yù)組血漿和肺組織NO含量較機(jī)械通氣組明顯降低（P＜0.01）。

圖4 機(jī)械通氣組大鼠肺組織iNOS蛋白（SABC）Fig.4 iNOS protein in lung tissue in ventilation group（SABC）

圖5 DXM干預(yù)組大鼠肺組織iNOS蛋白（SABC）Fig.5 iNOS protein in lung tissue in DXM group（SABC）

表2 各組大鼠血漿和肺組織中NO含量Tab.2 NO in lung and blood in groups

3 討論

呼吸機(jī)所致肺損傷（ventilator induced lung injury，VILI）是影響機(jī)械通氣臨床療效的一個(gè)重要因素，其發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，涉及面非常廣泛，是目前醫(yī)學(xué)界研究的熱點(diǎn)之一［2］。研究表明，大潮氣量機(jī)械通氣可引起炎癥細(xì)胞在局部肺組織聚集、活化，并釋放多種炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子［3］。這些炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子不但可直接造成肺組織損傷，還可激活更多的炎性細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)或細(xì)胞因子，從而形成瀑布效應(yīng)，使機(jī)體損害因素進(jìn)一步放大。本研究結(jié)果顯示，機(jī)械通氣組大鼠肺組織可見(jiàn)彌漫性肺間質(zhì)水腫和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步證實(shí)大潮氣量機(jī)械通氣可導(dǎo)致急性肺損傷的發(fā)生。

一氧化氮（nitric oxide，NO）是由多種細(xì)胞產(chǎn)生的廣泛存在于生物體內(nèi)的小分子物質(zhì)，體內(nèi)NO主要由一氧化氮合酶（NOS）催化生成。NOS依其激活條件可分為固有型（cNOS）和誘導(dǎo)型（iNOS）兩種類型［4，5］。正常時(shí)，cNOS催化體內(nèi)生成少量NO，具有多種重要的生理功能。在病理?xiàng)l件下，由iNOS誘導(dǎo)產(chǎn)生的大量NO則可作為一種炎性介質(zhì)參與多種疾病（如支氣管哮喘、急性呼吸窘迫綜合征）的發(fā)病過(guò)程，日益受到了人們的關(guān)注［6，7］。然而，NO是否參與VILI的發(fā)生過(guò)程，目前文獻(xiàn)報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，機(jī)械通氣組大鼠肺組織iNOS mRNA及其蛋白表達(dá)水平，以及血漿和肺組織NO含量均明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明大潮氣量機(jī)械通氣可誘導(dǎo)局部肺組織iNOS高表達(dá)而合成大量NO，后者不但具有細(xì)胞毒性作用，還可參與體內(nèi)氧自由基形成，促進(jìn)體內(nèi)炎癥反應(yīng)，從而直接和間接引起肺組織損傷［2］。

糖皮質(zhì)激素（glucocorticoids，GCs）是一種藥理作用廣泛的藥物，對(duì)非特異性炎癥反應(yīng)具有明顯抑制作用。研究表明，GCs不但能抑制PMN和血小板聚集、活化，還能促進(jìn)肺表面活性物質(zhì)的合成，穩(wěn)定溶酶體膜，減少溶酶體酶及相關(guān)介質(zhì)的釋放，因而很早就用于ALI/ARDS的治療［8，9］。近年來(lái)，GCs對(duì)iNOS及NO的作用逐漸被人們所認(rèn)識(shí)。有人在LPS誘導(dǎo)的急性肺損傷動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)證明，地塞米松可使肺組織iNOS mRNA表達(dá)量明顯減少，且具有劑量相關(guān)性，提示GCs可在轉(zhuǎn)錄水平上抑制iNOS的活性，從而減少NO的生成［10］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，DXM干預(yù)組大鼠肺組織iNOS mRNA及其蛋白表達(dá)水平，以及血漿和肺組織NO含量均較機(jī)械通氣組明顯降低，說(shuō)明糖皮質(zhì)激素可通過(guò)抑制肺組織iNOS的表達(dá)，減少NO生成，對(duì)機(jī)械通氣大鼠肺組織具有一定保護(hù)作用。然而，糖皮質(zhì)激素究竟通過(guò)何種途徑抑制肺組織iNOS表達(dá)，目前尚不清楚，推測(cè)其作用可能與其抑制PMN等炎癥細(xì)胞活化及釋放炎性介質(zhì)有關(guān)，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究［11］。

綜上所述，機(jī)械通氣可使肺泡上皮及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到過(guò)度牽拉，導(dǎo)致氣血屏障結(jié)構(gòu)受損，使炎癥細(xì)胞、炎性介質(zhì)和細(xì)胞因子構(gòu)成的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)失控，從而誘導(dǎo)iNOS mRNA及其蛋白高表達(dá)，產(chǎn)生大量?jī)?nèi)源性NO而引起肺組織損傷。糖皮質(zhì)激素可通過(guò)抑制肺組織iNOS mRNA及其蛋白的表達(dá)，減少NO的生成，對(duì)VILI具有一定防治作用。

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