Fmr1基因敲除對小鼠生理發育和繁殖性能的影響

戴麗軍，葉炳飛，黃月玲

（廣州醫學院實驗動物中心，廣州 510182）

人類脆性X綜合征（fragile X chromosome syndrome，FraX）是最常見的遺傳性智力低下疾病之一，目前發現X染色體上Fmr1基因的缺陷是該病的誘因。Fmr1基因的表達產物是FMR1蛋白（FMRP），FMRP在生物體中樞神經系統和生殖系統的發育過程中起著重要作用［1］。Fmr1基因敲除小鼠（FVB.KO）是以正常近交系FVB小鼠為背景，利用基因敲除技術將Fmr1基因定點滅活制備而成的動物模型［2］，目前已廣泛應用于FraX的研究。

我們利用毒理學和畸胎學相結合的行為致畸試驗方法［3］，對廣州醫學院實驗動物中心飼養的清潔級FVB.KO和FVB進行了一系列生長發育和神經行為功能的測試，并對所獲得的數據加以分析比較，借以了解Fmr1基因敲除對動物的繁殖性能和生理發育、尤其是子代神經系統功能發育的影響，為該基因敲除品系小鼠的研究應用提供背景資料。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

FVB.KO和FVB于2002年由廣州醫學院神經科學研究所從荷蘭Erasmus大學實驗動物科學中心引進，經廣州醫學院實驗動物中心繁育飼養，分別建立了清潔級種群。（合格證號：2004A053和2004A052）。

選取10周齡清潔級FVB.KO和FVB種鼠各20只，雌雄各半進行實驗。

1.2 實驗環境

實驗小鼠均飼養在清潔級環境中，合格證號：飼養環境2004B022；實驗環境2004C075。室內溫度為20℃～26℃，相對濕度為50％～70％，光照明暗交替12h：12h。

1.3 實驗儀器

JJ100電子天平，精確到0.01g。常熟雙杰測試儀器廠制造。

1.4 測定方法

選用10對FVB和10對經PCR檢測為FVB.KO的10周齡種鼠，采取1∶1全部同胞兄妹近親繁殖的方法，連續生產。動物飲用酸化水（pH2.5～3.0），食用全價營養飼料，飲水和飼料每日更換一次，墊料每周更換兩次，所用物品均通過高溫高壓滅菌（121℃，30min），飼養流程嚴格按照清潔級實驗動物設施SOP操作。

選取各對第2胎仔鼠進行繁殖性能和生理發育的觀察記錄。

繁殖性能測定指標包括：窩產仔數、初生仔鼠體重、初生仔鼠體長、離乳均重、離乳體長、雌雄比例和離乳率［4］。

生理發育測定指標包括：耳廓分離、體毛長出、門齒萌發和眼瞼開裂［5］。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 Fmr1基因敲除小鼠的繁育

FVB.KO小鼠為近交系小鼠，按照要求，選擇遺傳特征穩定、繁殖能力強、母性好的FVB.KO全部同胞兄妹，按雌雄1∶1的方式進行繁殖。圖1～4顯示的是FVB.KO小鼠的正常繁育狀態。

圖1 雌雄1∶1同胞兄妹繁殖（雌鼠已孕）Fig.1 Brother-sister breeding（the male mouse was pregnant）

圖2 帶乳鼠Fig.2 Lactation mouse and suckling mice

圖3 雌雄種鼠及新生鼠Fig.3 Father，mother and newborns

圖4 雌雄種鼠及幼鼠Fig.4 Father，mother and their babies

2.2 Fmr1基因對小鼠繁殖性能的影響

經t-檢驗，與FVB比較，FVB.KO的窩產仔數、離乳率等值偏低，但無顯著差異（P＞0.05）。兩品系的雌雄比例有極顯著差異（P＜0.01）（表1）。

表1 FVB.KO與FVB的繁殖性能Tab.1 The reproduction performance in FVB.KO and FVB

2.3 Fmr1基因對小鼠生理發育指標的影響

經t-檢驗，兩品系在耳廓分離、體毛長出、門齒萌發和眼瞼開裂的時間方面差異不顯著（表2）。

表2 FVB.KO和FVB生理發育指標測定Tab.2 The indices of behavioral development in FVB.KO and FVB

3 討論

實驗動物品系在長期封閉繁育的過程中，基因得以明確并穩定遺傳，形成了各自遺傳特性（包括繁殖性能）方面的明顯差異［6］。Fmr1基因敲除小鼠（FVB.KO）是以正常的近交系FVB小鼠為背景，利用基因敲除技術，敲除X染色體上的脆性X智力低下1號基因（fragile X retardation-1，FMR1）制備的人類脆性X綜合征（fragile X syndrome，FraX）動物模型。Fmr1基因在生物體發育過程中持續表達，具有組織特異性和時間特異性，該基因參與中樞神經系統和生殖系統發育過程的調節。脆性X綜合征是一種發病率僅次于先天愚型的遺傳性先天性智力低下綜合征，是由Fmr1基因缺陷引起Fmr1蛋白（fragile X retardation-1 protein，FMRP）合成減少而導致的，是X連鎖不完全顯性遺傳病。該病在人群中發病率男性約1/4000，女性約1/8000。患者的體征、認知及行為特征取決于性別和分子突變情況［7-9］。

神經行為毒理學方法通常用于篩檢具有神經毒性的化學物和藥物，主要分為兩類：生理發育和行為分析。1991年，美國EPA提出行為測試指南包括行為功能觀察、活動度、程度控制行為測定，后來又增加發育神經毒測定，包括行為功能測定、活動度、聽覺驚愕、學習和記憶等［10］。鑒于神經系統的發育是一個精密的時程化改變過程，這一過程中的每一步驟都必需在時間和空間上準確無誤地進行，任何一個環節發生障礙都將導致神經功能的改變［3］，我們將這一方法推廣至研究與神經系統生長發育相關的基因功能的檢測，為神經系統發育的基因作用提供簡單有效的評價手段。

在實驗中我們選擇遺傳特征穩定、繁殖能力強、母性好的FVB.KO和FVB進行繁育，對各品系第二胎新生仔鼠的多項生理發育和繁殖性能指標進行了較全面的測定分析［3-6］，初步研究了Fmr1基因敲除對動物繁殖與生理發育的影響。在繁殖性能方面，FVB.KO不僅具有其背景FVB的特點，而且具有基因敲除后形成的自身特點。FVB.KO除窩產仔數、離乳率等指標偏低外，與FVB比較，最大的差異是雌性后代所占的比例明顯降低。從實驗結果可知，FVB雌性后代數量是其雄性后代數量的1.64倍，而FVB.KO則是0.85倍，兩者間差異極顯著。造成這種結果的原因尚待進一步分析，我們會在今后的繁育過程中密切跟蹤。在生理發育方面，FVB.KO與FVB在耳廓分離、體毛長出、門齒萌發和眼瞼開裂的發育時間上較接近，沒有明顯差異。可初步得出結論：FMR1基因的破壞對小鼠生理發育各項指標的影響不大。

［1］黃濤，沈巖，吳冠蕓.FMR1基因結構與功能［J］.生理科學進展，1995，26（3）：218-222.

［2］Cathy E.Bakker，Coleta Verheij，Rob Willemsen，et al.Fmr1 Knockout Mice：A model to study fragile X mental retardation［J］.Cell，1994，78：23-33.

［3］姬艷麗，佘素貞，豆正東，等.昆明種小鼠正常行為發育指標探討［J］.安徽醫科大學學報，2002，37（6）：429-432.

［4］吳清洪，顧為望，張嘉寧，等.SPF級C57BL/6J小鼠生長發育和繁殖性能指標的測定［J］.中國比較醫學雜志，2006，16（10）：606-607，614.

［5］Brunner RL，Mclean M，Vorhees CV，et al.A comparison of behavioral and anatomicalmeasures of hydroxyurea induced abnormalities［J］.Teratology，1978，18：379-384.

［6］任連生，白喜花，閆磊，等.SX1近交系小鼠生長繁育主要指標的測定［J］.中國比較醫學雜志，2007，17（8）：470-472.

［7］羅莉，鄔晉芳，夏露.脆性X綜合征FMR1基因研究進展［J］.中國婦幼健康研究，2006，17（5）：415-417.

［8］戴麗軍，黃莉，廖軍.長爪沙鼠血清雌性激素的比較研究［J］.中國實驗動物學報，2005，13（4）：246-248.

［9］黃濤，沈巖，吳冠蕓.FMR1基因結構與功能［J］.生理科學進展，1995，26（3）：218-222.

［10］Karlberg J.兒童早期生長遲緩［J］.中華兒童保健雜志，1996，4（3）：11-12.