影響血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實驗結果的常見因素及相應對策

賀智英

延安大學醫學院，陜西延安 716000

醋酸纖維薄膜電泳是以醋酸纖維薄膜作支持物的一種區帶電泳技術，因其有快速省時、分辨能力強、操作簡單、成本低廉、透明后利于掃描定量及長期保持等優點，被廣泛應用于血漿蛋白、脂蛋白、糖蛋白、核酸及其他生物大分子的分析檢測，已成為醫學和臨床檢驗的常規技術，血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實驗也成為了生物化學實驗課程必開的基礎實驗項目之一。但該實驗影響因素很多，每個環節的失誤都會對實驗結果產生影響而得不到理想的圖譜，并且還造成很大浪費。筆者結合多年的實驗教學經驗對影響本實驗結果的常見因素進行分析探討，并提出了相應的解決對策。現報道如下：

1 電泳前準備的影響因素

1.1 醋酸纖維薄膜的因素

1.1.1 醋酸纖維薄膜的選擇 醋酸纖維薄膜如果厚度不一、粗面細孔不均、脆性不一，在電泳時會出現區帶不均勻、白色斑點處蛋白質不泳動而影響圖譜的效果[1]。對策：①購買知名度相對高的正規廠家生產的產品；②將干膜片漂浮于電極緩沖液表面，如漂浮20 s左右時，膜片出現白斑點或條紋，應舍去不用[2]。

1.1.2 醋酸纖維薄膜的浸泡 由于醋酸纖維薄膜親水性比較低，浸泡時間過短，不能保證膜片上有一定量的緩沖液，難以使其恢復原來多孔的網狀結構，所以浸泡時間不少于30 min。浸泡時用鑷子將纖維薄膜條粗面向下平穩放入緩沖液中，使其自然濕潤沉下液面或用手輕搖裝液外盒，不要用鑷子、玻棒等器材按壓纖維素薄膜沉下液面，也不要同時將多條纖維素薄膜一起放進緩沖液盒。

1.2 標本的因素

1.2.1 血清標本的新鮮度 不新鮮血清標本蛋白質電泳圖譜α2與β之間可能會多出現一條粗而染色均勻的區帶，也可能會出現電泳圖譜區帶不清晰，比較離散，甚至有拖尾現象[1]。有研究證明，在2～8℃冰箱保存血清標本，第1天與第2天標本中各蛋白質組分百分比變化無統計學意義，從第3天開始，標本中白蛋白百分比下降，α1-球蛋白、α2-球蛋白和β-球蛋白百分比上升均有統計學意義[3]。因此，必須使用新鮮的血清，如新采取血清標本不是馬上用，則必須放4℃冰箱貯存保鮮，但時間最多不能超過48 h。

1.2.2 溶血標本 溶血標本中白蛋白降低，α2-球蛋白、β-球蛋白升高。嚴重溶血時可見α2、β球蛋白區帶重疊，區帶百分比增加[4]，因此應采用清亮無溶血的血清標本。

1.2.3 點樣標本的替代 有文獻報道，在實驗教學中用雞蛋白（雞蛋清∶緩沖液=1∶9）代替血清作為點樣樣品，加樣量約 3 μl，可取得卵轉鐵蛋白、卵白蛋白、溶菌酶和卵黏蛋白4條電泳區帶[5]。用雞蛋白作為實驗材料，既取材方便，又能節約成本。

1.3 緩沖液的因素

1.3.1 緩沖液的離子強度及pH值 緩沖液的離子強度應為0.06，pH應為8.6。如離子強度過低緩沖容量小，不易維持緩沖液的pH值恒定，同時導致樣品所載電流增加，電泳速度加快，帶電顆粒在介質上擴散嚴重，分辨力明顯降低，區帶展開延長，導致區帶拖尾[6]。pH過高、過低也會影響實驗結果。研究證實，隨著電泳次數的增加，巴比妥緩沖液的pH發生變化，且陽極變化明顯，導致電流強度、蛋白遷移率、蛋向區帶均變小，故巴比妥緩沖液實驗6次左右就應更換，否則會發生明顯拖尾現象[7]。對策：①選擇沒有失效的分析純藥品；②用電子天平準確稱取藥品，精確到0.001 g；③配好后用pH計校正；④學生多次使用時，應在每次電泳前將正負兩極的緩沖液混勻再分別加入電泳槽兩極，保證緩沖液pH值穩定或重新配置新的緩沖液。

1.3.2 緩沖液的替代 巴比妥緩沖液中巴比妥有毒性，長期接觸會對人體產生傷害，且實驗教學中大量使用費用較貴。有實驗證明，用硼酸緩沖液（離子強度：0.08；pH 8.6）代替巴比妥緩沖液能得到更清晰、更理想的電泳圖譜[8-9]。硼酸緩沖液連續電泳實驗10次蛋白仍可分離清晰，這樣既減少了避免了巴比妥對操作者的傷害，又減少了成本。

1.4 點樣的因素

點樣是本實驗關鍵的一步，點樣前薄膜的準備、點樣器的選擇、點樣位置的選擇、點樣的量的多少都直接影響最后圖譜的效果。

1.4.1 點樣前薄膜的準備 浸泡好的薄膜吸得過干，電泳時電流不易通過薄膜，樣品在薄膜上流動困難，易導致電泳圖譜有條痕；亦不能留存過多的緩沖液，以避免點樣時血清隨著緩沖液而擴散開來，導致電泳圖譜分離不齊[10]。因此只要用濾紙輕輕吸取薄膜上的多余水分即可。

1.4.2 點樣器的選擇 傳統用載玻片端面點樣，因其寬度稍大于薄膜寬度，點樣血清會橫跨薄膜，產生明顯的邊緣效應，且有拖尾現象。有文獻報道，用自制點樣器（將寬為1.3 cm的訂書針折成0.4 cm寬，拋光，再將兩頭插入小塊有機玻璃作為手柄）得到的電泳圖譜中蛋白質條帶無邊緣效應，也無明顯拖尾現象[11]，并且可以在同一張薄膜上點樣兩次，在實驗教學中可增加學生的訓練次數。

1.4.3 點樣位置的選擇 點樣太靠薄膜邊緣，易產生邊流現象；點在薄膜光澤面上，則血清不能滲入薄膜，圖譜不清晰。所以應點在無光澤面距邊緣1.5～2.0 cm處，點樣線與薄膜短邊平行。

1.4.4 點樣的量 點樣的量太多易導致電泳圖譜分離不良或產生拖尾現象；點樣的量太少會使圖譜區帶顯色過淺。加樣量的多少與電泳條件、樣品的性質、染色方法與檢測手段靈敏度密切相關，如電泳后要用洗脫法定量時，每厘米加樣線上加樣量為 0.1～0.5 μl，相當于 5～1000 μg；如是血清蛋白常規電泳分離時，加樣量不超過每厘米 1 μl，相當于 60～80 μg。對策：對每一種樣品的加樣量應先做預實驗；點樣前應在濾紙上反復練習，掌握點樣技術后，再以印章法使點樣后的樣品呈一條線涂于纖維薄膜[12]。

2 電泳時的影響因素

2.1 搭橋

根據電泳槽裁剪大小合適的濾紙或脫脂紗布，使其對折后一端的長邊能浸入緩沖液中，另一端的長邊與支架前沿對齊。待濾紙完全浸透后，用玻璃棒輕輕擠壓膜支架上的濾紙或紗布以驅趕氣泡，使其緊貼在膜支架上[13]。

2.2 平衡

薄膜傾斜放置，電泳圖譜會出現要靠近陽極越窄。薄膜搭在濾紙橋時應將無光澤面向下，點樣端放在負極，加樣線距離橋墊2 mm左右；膜條要緊貼濾紙橋不能有氣泡；膜條要拉直，不能下垂。蓋上電泳槽蓋平衡10～15 min。

2.3 通電

2.3.1 通電電壓電流 電壓過高，圖譜展開短，蛋白質各組分之間出現擠壓，區分困難；反之，以低電壓進行電泳時，樣品泳動速度慢且易擴散，所呈現的圖譜常有“拖尾”現象。總電流要根據放入膜條的多少計算后調節，如果太大會將膜條燒斷[6]。按電場強度10～12 V/em（指薄膜與濾紙橋總長度），電流強度0.5～0.8 mA/em膜寬（指薄膜數目的總寬度）進行計算，并以控制電流大小為主效果較好[14]。

2.3.2 通電時間 電泳時間的長短跟室溫是密切相關的，具體可待電泳區帶展開3.5～4.0 cm后關閉電源。

3 電泳后的影響因素

3.1 染色

染色時間過長，薄膜底色難以脫掉，時間過短，區帶不易區分；多條薄膜放入染液時重疊易致染色不良。因此薄膜應一條一條逐次放入染液，保證前一條薄膜染色固定后再放入下一條，并輕輕搖動染色杯，染色10 min即可。

3.2 漂洗

漂洗液成分主要為乙醇，易發揮，所以應密封保存或在臨用前配制。為節省洗液，用鑷子將薄膜從染液中取出時盡量瀝去染液。另外，溫度對薄膜漂洗結果也有影響，如室溫過低，可將漂洗杯放入恒溫水浴箱，不能超過25℃，能提高漂洗效率，又不影響實驗結果[15-16]。因此，只需準備3杯漂洗液，將薄膜依次放入3份洗液中，每次5 min即可達到漂洗的目的。

綜上所述，影響血清蛋白醋酸纖維薄膜電泳實驗的因素很多，在實際操作過程中想要得到理想的圖譜而又不造成浪費和污染，就必須選擇最佳的操作條件和操作方法，盡量避免和減少上述影響因素的影響，以達到臨床檢驗和教學實驗的目的。

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