基于正交試驗(yàn)的野木瓜中反丁烯二酸提取工藝的優(yōu)化

胡書平，劉同祥，劉世杰

中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081

基于正交試驗(yàn)的野木瓜中反丁烯二酸提取工藝的優(yōu)化

胡書平，劉同祥，劉世杰

中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院，北京 100081

目的：采用高效液相色譜法，利用正交試驗(yàn)L9（34）探究野木瓜中有機(jī)酸的最佳提取工藝條件。方法：運(yùn)用正交試驗(yàn)對(duì)貴州野木瓜干燥根莖的提取條件進(jìn)行探究，采用HPLC測定反丁烯二酸的含量。結(jié)果：極差分析表明，在各提取條件中，對(duì)反丁烯二酸的含量影響的順序是：溶劑種類＞提取次數(shù)＞提取時(shí)間＞料液體積比；方差分析表明，溶劑種類的差異性大于其他三個(gè)因素。結(jié)論：運(yùn)用正交試驗(yàn)得到野木瓜最佳提取工藝是：90%的乙醇提取3次，每次2 h，料液體積比8倍量較為合適，且各項(xiàng)考察結(jié)果均符合要求，提示該提取工藝切實(shí)可行，為野木瓜中反丁烯二酸的含量測定提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

野木瓜；正交試驗(yàn)；反丁烯二酸；高效液相色譜法

野木瓜（starntonia chinensis DC.），常用名七葉蓮，為木通科（Lardizabalaceae）野木瓜屬植物，性溫，味微苦，具有祛風(fēng)止痛及舒筋活絡(luò)等功效[1-2]。臨床用于各種手術(shù)止痛、坐骨神經(jīng)痛、腰椎骨質(zhì)增生、跌打損傷等，療效顯著，且具有無耐藥性、無成癮性、毒副作用小的特點(diǎn)[3-4]，是衛(wèi)生部公布的藥食兩用植物，全株具有較高的藥用價(jià)值。原標(biāo)準(zhǔn)中有一個(gè)顯微鑒別，但未見該藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究的報(bào)道。為了探究野木瓜中反丁烯二酸的含量，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用高效液相色譜法測定野木瓜中反丁烯二酸的含量，并進(jìn)行方法學(xué)研究，為野木瓜的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供一定的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters 600-2996高效液相色譜儀（美國Waters公司），Waters 2996檢測器，Empower色譜工作站；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）；Metiler Toledo AL104電子天平（瑞士Metiler公司）；KQ-500E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司，功率500 W，頻率40 kHz）。

1.2 試劑

反丁烯二酸對(duì)照品（購自中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：1541-200001）；甲醇、乙腈為色譜純（美國 Fisher Chemical），水為超純水，磷酸等其余試劑均為分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥材

野木瓜購于安徽亳州藥材市場，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)張貴君教授鑒定為木通科野木瓜屬野木瓜Starntonia chinensis DC.的干燥根莖。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取方法考察

分別以超聲提取、回流提取進(jìn)行考察，結(jié)果表明回流提取效果優(yōu)于超聲提取，同時(shí)回流提取是較傳統(tǒng)、方便的提取方法，故選取回流提取方法。

2.2因素水平的確定

參照文獻(xiàn)[5]報(bào)道，并根據(jù)野木瓜藥材的理化性質(zhì)，提取工藝選取了對(duì)提取率影響較大的溶劑種類 （A）、提取時(shí)間（B）、料液體積比（C）和提取次數(shù)（D）作為參考因素，以反丁烯二酸的含量為考察指標(biāo)，選定L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。正交因素水平見表1。

表1 提取因素和水平

2.3 試驗(yàn)方法

取野木瓜藥材，40目過篩，精確稱取30 g，按照正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行試驗(yàn)。

2.4 HPLC法測定反丁烯二酸的含量[6-7]

2.4.1 色譜條件 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（5∶95）；檢測波長為 215 nm；流速為 1 ml/min；柱溫為30℃；進(jìn)樣量均為20 μl。理論塔板數(shù)按反丁烯二酸峰計(jì)算不低于2 500，保留時(shí)間在8 min左右。反丁烯二酸色譜圖顯示，樣品溶液的主峰保留時(shí)間與對(duì)照品一致，提示其他共存組分無干擾。見圖1。

圖1 反丁烯二酸對(duì)照品和野木瓜樣品溶液HPLC圖譜

2.4.2 對(duì)照品溶液的制備 取反丁烯二酸對(duì)照品適量，精密稱定，加色譜甲醇并稀釋制成0.04 mg/ml溶液，過0.45 μm濾膜，即得。

2.4.3 供試品溶液的制備 取提取液，減壓濃縮至約20 ml，用甲醇定容至100 ml，過0.45 μm濾膜，搖勻，即得。

2.4.4 測定方法 精密稱取9份正交試驗(yàn)樣品，制備成供試樣品溶液，進(jìn)行測定。吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各20 μl，注入HPLC色譜儀，記錄峰面積，在相同條件下每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，取平均值。按外標(biāo)法計(jì)算樣品中反丁烯二酸的含量。

2.5 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

采用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以反丁烯二酸的含量為檢測指標(biāo)，然后進(jìn)行極差分析和方差分析。見表2、3。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表及結(jié)果

表3 方差分析結(jié)果

極差分析表明，以反丁烯二酸的量為考察指標(biāo)，各因素對(duì)反丁烯二酸提取量的影響大小依次為：A＞D＞B＞C，其中提取溶劑種類（A）對(duì)反丁烯二酸含量的影響最大，提取時(shí)間（B）和提取次數(shù)（D）的影響次之，影響最小的是料液體積比（C）。

方差分析表明，F(xiàn)A=2.76，小于臨界值 F0.05（2，2）=19.00，因素A對(duì)反丁烯二酸提取量的影響不顯著。又因FB=0.70、FC=0.25、FD=1.03，均小于 FA，故因素 B、C、D 對(duì)反丁烯二酸提取量的影響也不具有顯著性。綜合方差分析結(jié)果得PA＜PD＜PB＜PC，與極差分析的結(jié)果相同。因此，在試驗(yàn)范圍內(nèi)，最佳優(yōu)選條件組合為A3B2C1D3，即野木瓜藥材加90%的乙醇提取3次，每次2 h，三次料液體積比為8∶1。

2.6 方法學(xué)考查

2.6.1 線性關(guān)系考查 分別精確移取對(duì)照品溶液，進(jìn)樣體積為20 μl，按上述色譜條件測定，記錄色譜峰面積，以進(jìn)樣濃度X（μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，考查對(duì)照品峰面積與對(duì)照品濃度（μg/ml）的線性關(guān)系。線性方程為Y=115 494.368 7X-96 957.422 9，相關(guān)系數(shù)r=0.999 9，線性范圍為 1.25～40.00 μg/ml。

2.6.2 陰性對(duì)照試驗(yàn) 分別精確移取色譜甲醇（溶解對(duì)照品的溶劑），進(jìn)樣體積為20 μl，按上述色譜條件測定，在8 min左右沒有色譜峰出現(xiàn)。結(jié)果表明，色譜甲醇中沒有反丁烯二酸，可以作為溶劑使用。

2.6.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取反丁烯二酸對(duì)照品溶液（40 μg/ml）20 μl，連續(xù)進(jìn)樣 3次，記錄平均峰面積為 4 527 353，RSD 為0.89%（n=5），表明儀器的精密度良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法，選擇正交試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝，即用體積分?jǐn)?shù)為90%的乙醇溶劑回流提取3次，每次2 h，料液體積比為8倍量，制備供試品溶液1份，每隔2 h測定1次，共測定5次，按上述色譜條件檢測，記錄峰面積。結(jié)果顯示，反丁烯二酸的平均峰面積為1 261 030，RSD=1.53%（n=5），結(jié)果表明供試樣品溶液在 8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取野木瓜藥材各5 g，共6份，按“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，選擇正交試驗(yàn)優(yōu)選的合理提取工藝，制備樣品溶液6份，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測定，結(jié)果6份樣品溶液反丁烯二酸含量的RSD為2.01%（n=6），表明反丁烯二酸測定方法具有良好的重復(fù)性。

2.6.6 加樣回收率試驗(yàn) 采用加樣回收法，精密稱取已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)的供試品，加入適量對(duì)照品溶液，以正交試驗(yàn)優(yōu)選的合理提取工藝，按“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法，混勻，制備成供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件測定6次，反丁烯二酸的平均回收率為98.67%，RSD=1.92%，表明該提取方法具有良好的回收率。

2.6.7 樣品含量測定 取反丁烯二酸對(duì)照品溶液，以等體積混合進(jìn)樣，測定峰面積和保留時(shí)間，反丁烯二酸在8 min左右出峰。分別精確稱取野木瓜藥材5 g，以正交試驗(yàn)優(yōu)選的提取工藝，按“2.4.3”項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備供試品溶液，按“2.4.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)行反丁烯二酸的含量測定，結(jié)果顯示，反丁烯二酸平均含量為38.56 μg/g，RSD為2.16%。

3 討論

3.1 含量測定方法的選擇

目前，野木瓜屬植物的化學(xué)成分研究和生物活性研究主要集中于黃酮類、多糖以及皂苷類[8]，對(duì)有機(jī)酸的研究少有報(bào)道，本試驗(yàn)參照鵝掌柴屬植物漢桃葉的有機(jī)酸含量測定方法，以反丁烯二酸為對(duì)照品檢測野木瓜中有機(jī)酸含量，色譜條件為：C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（5∶95）；檢測波長：215 nm，流速：1 ml/min；柱溫：30℃。利用HPLC方法學(xué)考察，結(jié)果表明，該方法能夠?qū)崿F(xiàn)野木瓜中反丁烯二酸的良好分離及準(zhǔn)確測定，方法簡便快捷，精密度高，重現(xiàn)性好。

3.2 檢測波長的選擇

取反丁烯二酸對(duì)照品適量，以流動(dòng)相配制成對(duì)照品溶液，置于紫外分光光度計(jì)下，于200～400 nm波長范圍內(nèi)掃描，結(jié)果反丁烯二酸對(duì)照品溶液在215 nm處有最大吸收，試驗(yàn)結(jié)果顯示，供試品在該測定條件下測定效果良好，故選擇215 nm為反丁烯二酸的檢測波長。

3.3 開發(fā)與應(yīng)用

野木瓜是貴州、江西等地區(qū)的重要藥材，野生資源極為豐富，僅江西贛南地區(qū)每年野生藥材的收購量就在100噸以上[9]。野木瓜在藥用、食用和觀賞等方面具有開發(fā)應(yīng)用價(jià)值，特別是藥用價(jià)值方面，臨床應(yīng)用于治療坐骨神經(jīng)痛等各種疼痛，療效顯著，但對(duì)野木瓜屬植物研究不足，至今，野木瓜屬植物的研究資料表明，對(duì)本屬植物資源的開發(fā)與應(yīng)用除野木瓜和六葉野木瓜兩種植物外，其余大部分種類的研究開發(fā)與利用工作尚未深入開展，在某種程度上阻礙了野木瓜屬植物藥用價(jià)值的開發(fā)。本研究運(yùn)用正交試驗(yàn)得出野木瓜中反丁烯二酸提取條件的最佳工藝，為野木瓜的進(jìn)一步深入研究提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

[1]中國植物志編委會(huì).中國植物志[M].29卷.北京:科學(xué)出版社,2001:23.

[2]張貴君.現(xiàn)代中藥材商品通鑒[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2001:1151,1190.

[3]史建敏,楊震玲,王秋梅,等.野木瓜用于術(shù)后鎮(zhèn)痛的療效[J].中國新藥與臨床雜志,2002,21(6):363-364.

[4]YE WB,LIU Q,YE Q,et al.The effects of injection stauntoniae on the condition of the saphenous nerve in rat[J].Chin Tradit Herb Drugs,1995,26(1):20-21.

[5]劉桂艷,張繼,鄭健,等.正交試驗(yàn)優(yōu)選木通中木通酸和木通皂苷Stc的提取工藝[J].北京理工大學(xué)學(xué)報(bào),2008,28(5):459-463.

[6]徐劍,張永萍.漢桃葉藥材含量測定方法的研究[J].貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,30(2):73-77.

[7]張國躍,羅定強(qiáng),喬蓉霞,等.漢桃葉片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[J].中成藥,2008,30(6):附9-10.

[8]陳國棟,楊磊,陳少丹,等.野木瓜屬植物化學(xué)成分和生物活性研究概況[J].中藥材,2008,31(2):309-315.

[9]吳國卿,王文平,陳燕.野木瓜的資源狀況與食品加工研究綜述[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,38(2):163-165.

Optimization of the extraction technics for fumaric acids from Starntonia chinensis DC.based on orthogonal test

HU Shuping,LIU Tongxiang,LIU Shijie
Institute of Chinese Minority Traditional Medical,Minzu University of China,Beijing 100081,China

Objective:To explore the best extraction conditions of fumaric acid in Starntonia chinensis DC.by using HPLC and orthogonal test L9(34).Methods:Orthogonal test was applied to probe the extraction process on dried leaf and stem of Starntonia chinensis DC.from Guizhou;HPLC was utilized to measure the fumaric acid content.Results:Range analysis showed that the extraction conditions on the content of fumaric acid was in the order:kinds of solvent＞extraction times＞extraction time＞volume ratio of solid;variance analysis indicated that kinds of solvent had greater effects than other factors.Conclusion:The optimal condition of the orthogonal test is that,the solid dissolved in 90%ethanol,extraction lasted for 2 hours,3 times,solid to liquid volume ratio of 8 is more appropriate and the results of method investigation comply with all requirements.The technique proves to be practical,which provides theoretical foundation for measuring the content of fumaric acid in Starntonia chinensis DC..

Starntonia chinensis DC.;Orthogonal test;Fumaric acid;HPLC

R282.71

A

1673-7210（2011）12（a）-077-03

胡書平（1984-），女，漢族，山東濟(jì)寧人，碩士研究生，主要從事民族新藥的研究與開發(fā)工作。

劉同祥（1968-），男，漢族，河南周口人，中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院教授；研究方向：民族藥物研究與開發(fā)。

2011-08-18）