2，4，6-三硝基苯酚降解菌的篩選和表征

孫秀云，沈錦優，王連軍，李健生，韓衛清

(南京理工大學 環境與生物工程學院，江蘇 南京210094)

0 引言

硝基芳香族化合物(Nitro-aromatic compounds，簡稱NAC)是重要的化工品，廣泛應用于火炸藥、農藥、殺蟲劑、除草劑、染料、醫藥等產品的生產［1-2］，這些行業生產廢水的排放對環境造成了嚴重污染。其中以火炸藥行業的污染最為嚴重，問題最為突出。而NAC 難以生物降解，可在環境中持續存在并可能在食物鏈中積累，對人類的毒性大并可引發嚴重的環境污染問題。

NAC 所造成的嚴重污染問題和NAC 的生物降解性能密切相關。硝基芳香族化合物由于苯環上硝基的吸電子作用［3］，苯環上形成了π 電子的缺電子特性，使好氧微生物加氧酶所催化的親電子氧化攻擊受阻，從而使硝基芳香族化合物難以實現好氧微生物降解。且該類物質的生物降解性能和取代基團的數量有關［4］。隨著硝基數目的增加，苯環上π 電子的缺電子特性增強，顯示出了高度的異型生物質特征，生物降解難度加大。單取代的硝基酚、硝基苯等芳香族硝基化合物是可實現生物氧化降解的，但是多硝基取代的芳香族硝基化合物，例如2，4，6-三硝基甲苯(TNT)、2，4，6-三硝基苯酚(TNP)等顯示出了很大的降解難度。這些難降解物質的存在，不僅難以實現開環氧化降解，且對生物處理系統產生了很大的毒害作用，造成了處理效率的降低，甚至微生物的死亡。因此，對芳香族硝基化合物，尤其是多硝基取代芳香族化合物而言，具有良好的降解能力、并能適應該類廢水復雜水質的高效降解微生物的篩選和馴化成為實現該類物質生物處理的關鍵。

2，4，6 -三硝基苯酚(TNP)是一種重要的硝基芳香族化合物，廣泛應用于K·D 復鹽、二硝基重氮酚(DDNP)等起爆藥生產中。由于TNP 生物降解性能差，目前關于該物質生物轉化的實例尚不多見［4-6］。此外，絕大部分TNP 降解菌株只能實現部分轉化，形成死端產品，而不能實現TNP 的完全礦化。因此，能夠實現TNP 礦化的降解菌株的篩選對TNP 污染的治理具有重要意義。

本研究從長期受到TNP 污染的工廠排污口土樣中分離TNP 高效降解菌株，對其進行菌種鑒定和降解機理的考察，以期為TNP 的生物降解提供菌株資源和可行性依據。

1 材料與方法

1.1 培養基

篩選和富集培養液S1 組成如下［4］:3.06 g Na2HPO4·12H2O，0.76 g KH2PO4，0.2 g MgSO4·7H2O，0.05 g CaCl2，適量TNP(TNP 的量根據實驗需要確定)和微量元素溶液，加入1 000 mL 蒸餾水中。上述S1 培養液加入15 g 瓊脂即為相應的S1 固體培養基。

培養液和培養基在使用前均采用高壓滅菌鍋在121 ℃條件下滅菌20～30 min.

1.2 TNP 降解菌株的篩選

試驗用土樣取自南京陶吳化工廠排污口。將5 g 土樣與含有50 mg/LTNP 的S1 培養液以1∶100 的質量比混合，放入三角瓶中，室溫下以180 r/min 的搖床轉速振蕩3 h，得泥水混合物。將泥水混合物稍作沉淀，將上層液體分裝入150 mL 的錐形瓶中(裝液量為50 mL)，搖床培養。約10 d 后，其中兩個錐形瓶中苦味酸所呈現的黃色褪去。將這兩個錐形瓶中的泥砂進一步沉淀，將該上清液轉接到含100 mg/L 苦味酸的S1 培養液中，進行菌種的富集。培養48 h 后，培養液褪色，重新轉接菌株，進一步提高培養液的濃度，重復該過程直至培養液中TNP 濃度達到500 mg/L.待TNP 濃度為500 mg/L 的培養液褪色后，將所得的菌懸浮液用無菌蒸餾水逐級稀釋，涂布于以TNP 為唯一碳源、氮源和能源的篩選培養基S1 平板上，放入培養箱28 ℃倒置培養。觀察菌體生長情況，并進行記錄。兩周后挑取單菌落，在LB 固體培養基上采用采用稀釋涂布的方法進行分離純化，進行斜面保存并編號。

1.2.4 TNP 降解菌株的復篩

挑取分離所得到的單菌落，分別接種于LB 培養液中，搖床培養至對數增長期。將所得菌體用無菌蒸餾水洗滌過程3 次。將菌體重新懸浮于無菌蒸餾水(調節加入的水量，控制菌懸浮液OD600約為2.0)，得到種子液。

將各單菌落的種子液接種于含500 mg/L TNP的S1 培養液中，考察接種菌株的培養液有無顏色變化，如果培養液顏色發生變化，即可表明TNP 發生了降解。將TNP 降解菌轉接于S1 固體培養基進行保存。分別制備各降解菌的種子液，接種于S1 培養液中，定時取樣，測定OD600值，并測定過濾液COD濃度、TNP 濃度，以衡量降解效果，對篩選得到的TNP 降解菌降解性能進行進一步的比較。

1.3 TNP 降解菌株的鑒定

1.3.1 降解菌株16S rDNA 的提取

將菌體重新懸浮于150 μL 經過滅菌的純凈水中;向離心管中加入10 μL 濃度為5 mg/mL 的溶菌酶用以破碎細胞壁;向離心管中加入40 μL 濃度為10%的SDS(十二烷基硫酸鈉)，65 ℃下放置30 min;30 min 后，向離心管中加入20 μL 濃度為10 mg/mL 的蛋白酶K，37 ℃下放置4 h;將400 μL 的STE 緩沖溶液(組成為:NaCl，0.1 M;Tris-HCl，10 mM，pH 為8.0;EDTA，1 mM)加入離心管;加入等體積的的苯酚-氯仿，并于12 000 r/min 的轉速下離心5 min，將上清液加入新離心管重復萃取過程，以消除雜質影響;萃取完成后，向上清液中加入50 μL醋酸鈉溶液(3 M，pH 為5.2)和1 mL 95%的乙醇，沉淀10 min;將移液槍槍尖剪掉，在酒精燈火焰上燙去邊角，用該槍頭吸取含DNA 的懸液進行攪動;吸取含DNA 的懸液，轉入70 μL 無菌純凈水中，備用于下一步的PCR 擴增。

1.3.2 降解菌株16S rRNA 基因的PCR 擴增及測序

以總DNA 為模板，用正向引物P1:5'-GAATTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3'(對應于大腸桿菌的第11～37 堿基位置)，反向引物P6:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCAC-3'(對應大腸桿菌的第1 451～1 503 位置)經PCR 反應擴增出16SrDNA.

PCR 反應體系(總體積為20 μL):10 ×buffer，2 μL;dNTPs，0.5 μL;正向引物，0.5 μL;反向引物，0.5 μL;MgCl2溶液，2 μL;Taq 聚合酶，0.5 μL;DNA模板，1 μL;ddH2O，13 μL.

PCR 反應條件:

1)94 ℃預變性2 min.

2)94 ℃，1 min;58 ℃，30 secs;72 ℃，2 min(35個循環).

3)72 ℃延伸8 min.

4)4 ℃保存.

將得到的目的DNA 進行16S rDNA 測序。測序儀器為Applied Biosystems 公司生產的3700 DNA Analyzer.

1.3.3 系統發育分析

將得到的1 339bp 序列與美國國家生物技術信息中心(National center for biotechnology information，簡稱NCBI)的GenBank 中核酸數據庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進行同源性對比，并構建系統發育樹。

1.4 TNP 降解中間產物分析

為確定TNP 的降解機理，本研究采用紫外可見光譜、紅外譜圖等分析手段，對代謝產物進行分析。

配制S1 培養液(含500 mg/L TNP)，接種。搖床培養直至培養液變為無色。用0.22 μm 的濾膜過濾培養液并收集濾液200 mL.將200 mL 降解后的培養液濾液和200 mL 未經降解的S1 培養液利用旋轉蒸發儀在60 ℃條件下分別進行濃縮，得到泥狀固體物質。將泥狀固體物質在烘箱中60 ℃烘干。將得到的干燥固體研磨，進行KBr 壓片，測定得到紅外譜圖。

配制S1 培養液(含500 mg/L TNP)，接種，搖床培養。每隔4 h 取樣，用0.22 μm 的濾膜過濾培養液，將過濾清液稀釋50 倍，進行紫外可見光譜掃描分析。

1.5 測定和分析方法

用紫外可見分光光度計測定在波長為600 nm處的光密度(optical density)OD600值。COD 采用重鉻酸鉀滴定法測定(GB11914—89)。TNP 濃度采用高效液相色譜法測定。具體操作如下:取一定量水樣用0.22 μm 的濾膜過濾并適當稀釋進入色譜柱(Waters RP18 column (5 μm，3.9 ×150 mm))，柱箱溫度35 ℃.流動相A:乙腈;流動相B:超純水與H3PO4體積比為0.26%;流動相A 與B 體積比為3/7.流速為1.00 mL/min.雙極管紫外檢測器設定波長為254 nm，積分出峰面積并由標準曲線確定TNP 濃度。亞硝酸根離子的測定采用N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽分光光度法［4］。細菌的掃描電鏡觀察過程為:挑取單菌落，用無菌水稀釋，涂片;用4%的戊二醛和1% 的鋨酸固定;采用10%、30%、50%、70%、90%和100%的乙醇梯度洗滌;在臨界點干燥儀內進行干燥;噴金，掃描電子顯微鏡觀測并拍照。

2 結果與討論

2.1 苦味酸降解菌的篩選

經過富集和分離，將經過純化后所得到的菌株經過LB 培養液擴大培養，接種入以TNP 為唯一碳源、氮源的S1 培養液中。結果表明，所得的大部分菌株在以TNP 為唯一碳源和氮源的培養液中無TNP 降解能力(經過72 h 的培養，培養液仍然為黃色)。只有接種編號為NJUST6、NJUST9、NJUST16的菌株的培養液發生了顏色變化，培養液的顏色由最初的黃色變成橘紅色。繼續培養，培養液紅色消退，培養液變為無色(略帶淺黃)。NJUST6、NJUST9、NJUST16 均可在S1 固體培養基上生長，而S1 固體培養基則由初始的亮黃色變為橘紅色，最后變為無色。NJUST6、NJUST9、NJUST16 在瓊脂平板上的菌落形態相似，菌落光滑粘稠，色素為淡黃色;三種菌均呈革蘭氏陽性，好氧;均為桿狀菌，菌體不運動，不形成分生孢子或內孢子;其中NJUST16 菌曾觀察到無色的變異菌株。圖1為NJUST16 的掃描電鏡圖片。

圖1 NJUST16 菌的掃描電鏡圖Fig.1 The Scanning electron micrographs of NJUST16

為了進一步考察3 種菌對TNP 的降解能力，對3 種菌降解過程中S1 培養液的COD 和TNP 濃度變化情況進行了比較。由圖2可見，NJUST6、NJUST9和NJUST16 3 種菌均具有TNP 降解能力。在相同的接種量、相同的起始TNP 濃度、相同的培養歷史、相同的培養條件下，接種NJUST16 菌的體系在32 h內可實現2.18 mM(500 mg/L)TNP 的完全降解;而接種NJUST6、NJUST9 的體系分別需要44 h 左右才能實現完全降解。此外，3 種菌對COD 的降解能力也有差異。接種NJUST169 菌的培養液中的COD值經過32 h 的降解降到最低點，COD 去除率達到90%左右;接種NJUST6 和NJUST9 的培養液COD值分別經過44 h 達到最低點，COD 去除率分別為85%和67%.在降解終點，接種NJUST6 和NJUST9的培養液呈淺黃色，而接種NJUST16 的培養液基本呈無色。由此可見，NJUST16 菌相比NJUST6 和NJUST9，具有更強的TNP 降解能力。因此我們最終選取NJUST16 菌作為出發菌株，對其進行菌種鑒定，研究其降解TNP 的能力、降解機理，以期實現該菌的廢水處理應用。

圖2 接種NJUST6、NJUST9 和NJUST16 的培養液中COD 和TNP 濃度變化情況Fig.2 The COD and TNP concentration variation in the media inoculated by NJUST6、NJUST9 and NJUST16

2.2 TNP 降解菌的鑒定及降解能力

16S rRNA 在生物中高度保守，素有“生物化石”之稱［7］，已經成為一個分子指標，廣泛引用于菌種的鑒定，因此NJUST16 的鑒定主要基于16S rRNA序列分析。將測序得到的1 339bp 序列輸入到NCBI 的GenBank 數據庫中，獲得登陸號EF635425，用BLAST 工具將NJUST16 與已知的16S rRNA 基因序列進行同源性比較。在11 個與NJUST16 菌株最接近且同源性大于99%的菌株中，有10 株為紅球菌屬(Rhodococcus).一般認為序列相似性大于98%即可以認為是同種內的菌株。此外，結合NJUST16 菌形態特征、生理生化反應結果，可以判斷NJUST16菌為紅球菌屬(Rhodococcus)，命名為Rhodococcus sp.NJUST16.

由于TNP 的難生物降解性，目前已見報道的TNP 降解菌極其有限，主要集中在放線菌類的諾卡氏菌屬(Nocardioides)和紅球菌屬(Rhodococcus)［4-6］.這些降解菌株普遍具有降解速率低、可降解濃度低、降解條件苛刻的缺點。例如，針對750 mg/L 左右的TNP 的降解，接種Rhodococcus opacus HL PM-1 的體系，需要長達8.5 d 的時間才能實現TNP 的完全降解［5］;此外這些菌株可處理的TNP 最高濃度在較低，在Weidhaas 等［6］所報道的接種Rhodococcus opacus strain JW01 的SBR 反應體系中，TNP 處理濃度在200 mg/L 以下，且降解過程易受溫度影響。本研究所述的NJUST16 菌，可在32 h 內實現500 mg/LTNP 的完全降解(如圖2所示)。與文獻相比，NJUST16 菌具有較高的降解速率和耐受濃度，具有應用潛力。

2.3 NJUST16 對TNP 的降解中間產物分析

由圖2可知，在NJUST16 的作用下，S1 培養液中TNP 可發生降解和轉化，COD 也有了明顯降低。但是僅憑TNP 濃度和COD 濃度的變化，不能說明在NJUST16 作用下TNP 發生了礦化。本論文采用紫外可見光譜圖、紅外譜圖等分析手段，確定TNP在NJUST16 作用下的降解機理，為TNP 實現礦化提供直接的證據。

2.3.1 S1 培養液中NJUST16 的生長、TNP 的降解和亞硝酸根的釋放

如圖3所示，在NJUST16 的作用下，32 h 后S1培養液中TNP 濃度降到檢測限以下，細菌濃度達到最大(最大OD600增量約為0.38).此外，在TNP 降解過程中，可觀察到亞硝酸根離子的釋放。理論上每降解1 mol TNP 可釋放出3 mol 的亞硝酸根離子，而本研究表明每降解1 molTNP 約釋放出2.62 mol的亞硝酸根離子。亞硝酸根離子和降解TNP 摩爾比大于2，表明TNP 分子苯環上的3 個硝基均發生了脫落。

2.3.2 紫外可見光譜圖分析降解中間產物

圖4為含TNP 的S1 培養液在降解過程中的紫外可見光譜圖變化情況。TNP 在354 nm 處和250 nm 處有兩個特征吸收峰。隨著TNP 的降解，TNP的特征吸收在降低，至40 h TNP 的特征吸收已完全消失，同時在210 nm 處的吸收峰增強(圖4)。在210 nm 處的吸收峰推測為亞硝酸根離子及小分子有機物的特征吸收。可見TNP 在NJUST16 的作用下發生了降解和轉化，生成了一些小分子物質。

2.3.3 紅外譜圖分析降解中間產物

圖5為含TNP 的S1 培養液在經NJUST16 降解前后的紅外譜圖。在降解前，波數為3 070 cm-1處出現TNP 苯環的C—H 伸縮振動;波數為1 480 cm-1處出現TNP 苯環的 C==C 伸縮振動;波數為1 550 cm-1處出現TNP 苯環上硝基的反對稱伸縮振動;波數為1 340 cm-1處出現TNP 苯環上硝基的對稱伸縮振動;波數范圍為675～910 cm-1處出現TNP苯環的C—H 面外變形振動。經過NJUST16 的降解，以上吸收峰均得到了顯著的減弱或消失，表明經過NJUST16 的降解，TNP 的苯環發生了開環反應，同時發生了苯環上硝基脫除的反應。

圖3 S1 培養液中NJUST16 的生長、TNP 的降解和亞硝酸根離子的釋放Fig.3 Growth of NJUST16，degradation of TNP and the release of the nitrite in the S1 media

圖4 NJUST16 降解過程中S1 培養液的紫外光譜圖變化Fig.4 UV spectrum variation of S1 media during the degradation by NJUST16

圖5 TNP 經NJUST16 降解前(a)和降解后(b)的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)Fig.5 FTIR spectra of TNP before (a)and after (b)degradation by NJUST16

3 結論

1)利用以TNP 為唯一碳源、氮源的S1 培養基，從長期受到TNP 污染的工廠排污口土樣中，篩選得到三株可以TNP 為唯一碳源、氮源生長的菌株，其中NJUST16 菌降解TNP 的能力最為優異;

2)NJUST16 菌經16S rRNA 鑒定，確定為Rhodococcus，命名為Rhodococcus sp.NJUST16，Gen-Bank 登陸號為EF635425;

3)對Rhodococcus sp.NJUST16 降解TNP 的降解產物分析表明，TNP 在Rhodococcus sp.NJUST16的作用下，苯環上3 個硝基均發生了脫落，苯環發生了開環反應，并且無明顯的中間產物積累，最終TNP發生完全礦化。

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