新疆石榴皮多酚對實驗性結腸炎的藥效學研究

張 燕 張 紅 迪麗胡瑪爾 張?之*

1.蘭州軍區烏魯木齊總醫院，新疆烏魯木齊830000;2.新疆維吾爾自治區中醫院，新疆烏魯木齊830000; 3.新疆醫科大學藥理教研室，新疆烏魯木齊830011

石榴 (Punica granatum L.)，維吾爾語稱“阿娜爾”，是新疆和田、喀什等地特色果品，《本草綱目》記載具有止血解毒功效［1］。近年來因其抗氧化、抗菌抗炎、抗腫瘤、抗粘膜損傷、降糖降脂［2－5］等多種藥理學活性成為國內外研究熱點。潰瘍性結腸炎 (UC)在我國呈逐年上升趨勢，是結腸癌的高危因素，被WHO列為現代疑難病之一［6］。本實驗觀察了PPPE對UC小鼠的抗炎作用并探討其免疫相關機制，為石榴皮的深入開發提供一定理論依據。

1 材料

1.1 試藥 TNBS，50g·L－1，美國Sigma;柳氮磺胺吡啶，上海三維制藥;IL－17、IL－4試劑盒，北京福瑞生物公司;豚鼠血清，新疆醫科大學實驗動物中心提供。

1.2 儀器 賽多利斯電子分析天平、Hair超低溫冰箱、山東新華組織勻漿機、UV－2000分光光度計、BIO－RAD酶標儀等。

1.3 動物 健康昆明種 (KM)小鼠，雌雄各半，體重18～22g，新疆醫科大學實驗動物中心提供。

2 實驗方法

2.1 PPPE提取及總多酚含量測定 將新疆葉城縣石榴剝皮曬干粉碎、過20目篩，粗粉按料液比1∶20(g∶mL)用體積分數20%乙醇提取，濾液50℃真空濃縮冷凍干燥，得石榴皮多酚黃色粉末。Folin－Ciocalteu法測定，以沒食子酸表示的總多酚含量為32.7%。

2.2 動物分組給藥 KM小鼠隨機分4組，禁食12 h，分別i.g PPPE(500 mg·kg－1·d－1)、陽性對照柳氮磺胺吡啶 (SASP，0.5 g·kg－1·d－1)或等體積去離子水 (空白對照組和TNBS模型組)15 d.在連續給藥的第10 d，除空白對照其余各組小鼠乙醚輕度麻醉，用直徑2 mm的灌腸器從肛門處插入結腸約4 cm處，注入25 g·L－1TNBS50%乙醇溶液 0.1 m L·10 g－1(分兩次間隔12 h)，造成結腸炎模型［7］。在連續給藥的第11 d，除空白對照組外，每只小鼠腹腔注射5%雞紅細胞懸液0.2 m L進行免疫，各組小鼠在末次給藥24 h后取血處死。

2.3 一般情況觀察 每隔三日測大鼠體質量、觀察糞便性狀和隱血情況，參照文獻［8］行疾病活動指數評分。

2.4 結腸粘膜損傷指數評分 截取肛門至盲端腸段，沿腸系膜縱行剖開，用預冷的生理鹽水迅速沖凈，參照文獻［9］進行改進見下表，按該表計評各組總分值。

結腸粘膜狀況 分值腹腔粘連:無、輕度、中度、重度 分別記0、1、2、3分充血:無、輕度、中度、高度 同上水腫:無、輕度、中度或粘膜粗糙呈顆粒感、高度同上潰瘍糜爛:無、輕度、中度、嚴重糜爛、壞死及潰瘍1處最大縱徑﹤1cm 分別記0、1、2、3、4分潰瘍＞1處、潰瘍最大縱徑每超過1cm、腸壁增厚、穿孔，全段腸壁壞死、中毒性巨結腸、死亡加1分粘連+充血+水腫+潰瘍+加分項分值=總分值

2.5 血清溶血素 (SH)測定 取血，1500 r·min－1離心10 min得血清，用生理鹽水按1∶100稀釋，取稀釋血清1 m L，分別加入體積分數5%的雞紅細胞懸液0.5 mL，體積分數10%的豚鼠血清0.5 mL混勻，37℃溫育30 min后，0℃冰水中終止反應，1 500 r·min－1離心10min，取上清液于540nm測吸光度值。

2.6 取脾臟、胸腺、結腸稱重，計算臟器指數。取部分結腸、脾臟組織10%甲醛固定，石蠟包埋切片HE染色觀察組織病理學變化，剩余部分－80℃冷凍備用。

2.7 制備10%結腸組織勻漿，按試劑盒說明書酶聯免疫法(ELISA)檢測細胞因子IL－4，IL－17水平。

3 結果

3.1 PPPE對疾病活動指數、結腸粘膜損傷指數的影響

模型組小鼠體重下降，大便稀且有粘液便、血便，結腸黏膜出現不同程度的充血、水腫、增厚、糜爛潰瘍等，DAI值及CMDI評分顯著高于正常組，經PPPE干預后DAI及CMDI明顯改善，部分小鼠腸道可見潰瘍愈合疤點。結果見表1。

表1 各組DAI及CMDI比較±s，n=8)

表1 各組DAI及CMDI比較±s，n=8)

與正常對照組比:#;與模型組比較*P＜0.05，＊＊P＜0.01 (下同)

GROUP DAI CMDI＊＊Normal 0.05±0.01 0.00±0.00 TNBS 7.63±1.59## 9.83±1.64## SASP 4.50±1.19＊＊ 4.20±1.39＊＊PPPE 3.50±1.93＊＊ 4.38±1.42

3.2 PPPE對臟器指數的影響

模型組腸重指數提高、胸腺指數降低，這與肉眼觀察到的模型組有結腸腫大增厚及胸腺明顯萎縮相一致。PPPE能降低腸重指數 (P﹤0.05)，顯著提高脾臟指數但與模型組比較沒有統計學差異，這可能與取樣時間有關，該時模型組脾臟可能也有代償性增生。結果見表2。

表2 各組IWI、SI、THI比較±s，n=8)

表2 各組IWI、SI、THI比較±s，n=8)

GROUP IWI(g·g－1) SI(mg·g－1) THI(mg·g－1) Normal 0.015±0.003 2.91±0.70 2.43±0.60 TNBS 0.024±0.010# 3.52±0.18 1.02±0.21# SASP 0.021±0.005 3.13±0.51 2.33±0.41* PPPE 0.016±0.002*4.19±0.09# 1.35±0.13

3.3 PPPE對血清溶血素及結腸組織細胞因子的影響

脾細胞生成的抗體在補體存在條件下與抗原結合發生溶血反應，模型組血清溶血素明顯降低，IL－17水平增高，SASP組、PPPE組顯著升高血清溶血素水平，降低IL－17水平，說明PPPE能提高小鼠體液免疫功能，降低炎性細胞因子水平，結果見表3。

表3 各組血清溶血素及結腸組織細胞IL－17 IL－4含量比較 ±，n=8)

表3 各組血清溶血素及結腸組織細胞IL－17 IL－4含量比較 ±，n=8)

GROUP SH IL－17/pg·ml－1 IL－4/pg·ml －1 Normal 0.976+0.015 219.02±83.21 197.61±21.62 TNBS 0.180+0.053# 675.26±238.75# 126.25±51.41# SASP 0.570+0.201* 301.18±75.22* 139.64±69.78 PPPE 0.683+0.140* 298.47±114.16*141.91±77.31

3.4 結腸粘膜組織病理學變化 光學顯微鏡下可見正常組結腸結構清晰，上皮完整，粘膜層連續、層次明顯，杯狀細胞豐富，各細胞排列的緊密，腺管結構正常，無炎細胞浸潤;模型組上皮細胞嚴重損壞，黏膜脫落或壞死，黏膜和黏膜下層大量炎癥細胞浸潤，粘膜下水腫，潰瘍形成，腺體壞死;SASP組粘膜連續，粘膜下層少量炎癥細胞浸潤;PPP組粘膜完整，有水腫，少量炎癥細胞浸潤，結腸病理狀態明顯改善。見圖1。

3.5 脾臟組織病理學變化 正常對照組結構清楚，白髓中淋巴細胞密集;模型組白髓明顯減少，淋巴細胞密集度明顯下降;SASP陽性對照組有些區域白髓萎縮，淋巴細胞有減少;PPPE治療組接近正常。見圖2。

4 討論

本實驗對結腸粘膜損傷指數評分方法進行了優化改進，使各項指標清晰明確，每項指標又按程度給予不同層次評分，可操作性增強。研究發現石榴皮多酚對結腸炎癥損傷有明顯改善作用，其藥效可能與下調炎性細胞因子IL－17水平、提高脾臟抗體生成能力有一定關系。陽性對照柳氮磺胺吡啶組一只小鼠出現結腸膨大腫粗現象，有待研究。

目前結腸炎的發病機制尚不完全清楚，但大量研究表明免疫系統異常起著至關重要的作用［10］。近年研究發現輔助型Th17細胞產生的IL－17，很可能在自身免疫性疾病如類風濕關節炎、炎癥性腸病中發揮關鍵性免疫調節作用［11－12］，細胞因子IL－17與受體結合后，可通過活化MAP激酶和激活轉錄因子NF－κB，強大地募集和激活嗜中性粒細胞，誘導活化T細胞和刺激成纖維細胞、上皮細胞、巨噬細胞產生多種促炎介質:IL－1、6、8，TNF－α，NOS－2，單核細胞趨化蛋白－1 (MCP－1)、CAM－1、金屬蛋白酶和化學增活素而誘導炎癥反應局部化和擴大化，導致自身免疫性損傷甚至促進腫瘤發生和發展［13］。學者推測對抗IL－17可能成為治療UC的一個新手段，因此按現代作用靶點思路從傳統中藥中進一步尋找其有效成分對中藥現代化開發有重大前景。

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