肽酰基精氨酸脫亞胺酶4基因多態性與類風濕性關節炎及抗環瓜氨酸化蛋白抗體的相關性研究*

崔劉福，袁 偉，楊文浩，舒 榮，宋海澄，韓依軒，于 萍，王 建，王潔蕊

類風濕關節炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種累及周圍關節為主的多系統性炎癥性自身免疫病。它的一個顯著特點就是血清中存在多種抗體，抗環瓜氨酸化肽(CCP)抗體的研究是近年來診斷RA的重大進展，其特異性明顯優于類風濕因子(RF)，并可以與RF同時檢測，提高RA的診斷率。很多研究表明，抗瓜氨酸化抗原肽可能參與了RA的發病，其產量可能影響RA局部炎癥的發展。對蛋白質瓜氨酸化過程的研究發現，肽酰基精氨酸脫亞胺酶(PADI)是瓜氨酸化抗原肽產生的主要因素，它主要負責將精氨酸殘基轉化為瓜氨酸。2003年，Suzuki等發現，PADI4基因多態性與 RA的易感性有關，PADI4的SNP變異可影響PADI轉錄物的穩定性，從而影響抗瓜氨酸化抗原肽抗體的水平，但隨后在英國、法國、阿根廷和北美等國家和地區的研究并沒有得出一致的結論。RA屬于中醫“痹證”范疇。國內學者發現，不同證型RA患者基因表達和抗-CCP抗體(anti cyclic citrullinated peptide antibody，anti-CCP)水平存在差異，提示不同基因差異可能與RA的中醫證型有關。本研究選擇河北地區134例RA患者和140例健康對照，分別檢測了padi4_94位點的SNP和抗 CCP抗體滴度，以探討 PADI基因在RA發病機制中的重要作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集2007年10月至2009年10月在河北唐山開灤醫院住院的134例病人作為病例組，診斷均符合1987年ACR制定的RA分類診斷標準，其中女性87例，年齡21歲 ～82歲，平均年齡51.31歲 ±13.56歲;男性47例，年齡18歲 ～80歲，平均年齡48.17歲±13.41歲，病程從6個月到20年。均排除系統性紅斑狼瘡、多發性肌炎/皮肌炎、系統性硬化等結締組織病和脊柱關節病及感染、腫瘤等疾病。健康對照組為140例健康體檢人員，女性101例，平均年齡53.63歲 ±13.77歲;男性39例，平均年齡51.72歲±11.87歲，2組間性別、年齡比較均無統計學差異。

1.2 方法

1.2.1 血標本的采集 對照組及病例組均清晨空腹8h后，取肘前靜脈血3ml加2%乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝，置－20℃保存血樣。

1.2.2 DNA的提取 以酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，另取抗凝血4ml 3000p/min離心10min分離血清，取上層血清置EP管中－20℃保存。

1.2.3 引物設計 檢索Genebank獲得padi4_94位點(rs2240340)基因序列，設計引物序列，目的基因上游引物序列為:5’-CCTCTGACCA CACCTG TTCC-3’;下游引物 5’-TCGAACCTCTCAT TGTGG TG-3’。

1.2.4 PCR-LDR方法檢測SNP PCR擴增儀(PERKIN ELMER Gene Amp PCR system 9600)擴增基因組 DNA，反應體系為 20μl，含基因組 DNA1μl，d NTP2μl，引物各 0.4μl，1 × bμffer2μl，Mg2+2.4μl，TaqDNA聚合酶 0.2μl。反應參數為:95℃預變性15min，94℃ 變 性 30s，60℃ 退 火 90s，72℃ 延 伸 1 min，35次循環，72℃延伸7 min。3%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，觀察PCR產物的效果，PCR反應結束后，在LDR儀(PE9600)進行PCR產物的連接酶檢測反應，LDR反應體系為 10μl，含位點特異性探針 1μl，PCR 產物≥1μl，LDR 反應 bμffer 1μl，連接酶 0.05 μl(上海翼和公司)。LDR反應參數為:95℃預變性 2min，94℃30s，50℃ 2 min，35 次循環。然后對LDR產物進行測序儀(ABI 377)分析，并對測序儀結果做數據分析，得SNP位點基因型分型結果。

1.2.5 抗CCP抗體的檢測 檢測試劑盒購自英國(Axis-Shield Diagnostics Limited Anti-CCP ELISA)，嚴格按照操作說明書進行。

1.3 統計學分析

使用SPSS13.0軟件進行統計學分析，卡方檢驗分析基因型和等位基因頻率在RA組和健康對照組2組之間是否存在統計學上的差異，分別采用卡方檢驗和Mann-Whitney U檢驗比較不同等位基因與抗CCP抗體的相關性。

2 結果

2.1 padi4_94基因型與等位基因頻率的分布

表1顯示，RA病例組和健康對照組中padi4_94位點的基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P＞0.05)，表明樣本具有群體代表性。各基因型頻率分布在病例組與健康對照組間差異具有統計學意義(P=0.035)。在所有病例、對照人群中攜帶AG基因型者患RA的可能性是GG基因型的2.010倍(OR=2.010，95%CI=1.162 －3.476)，且攜帶 A等位基因與RA存在相關性(OR=1.434，95%CI=1.022-2.014，P=0.037)。

2.2 padi4_94位點A等位基因與RA患者中抗CCP抗體的相關性

表2顯示，以5U/ml作為抗CCP抗體的診斷界點，比較攜帶RA易感等位基因A陽性組和陰性組中抗CCP抗體的陽性率，2組相比差異具有統計學意義(X2=7.688，P=0.006)，其中陽性組中抗CCP抗體的陽性率高于陰性組。A等位基因陽性組的抗CCP抗體滴度明顯高于陰性組，差異具有統計學意義(P=0.023)。

表1 padi4_94位點基因型及等位基因頻率在病例組和對照組中的分布

表2 抗CCP抗體陽性/陰性與A等位基因相關

3 討論

RA的病因復雜，多基因和環境因素的共同作用誘發病理性自身免疫反應，導致RA的破壞性多關節炎和多種關節外炎癥表現。抗瓜氨酸肽抗體(anti-CCP)是目前所發現的對RA特異性最高的抗體，而在抗瓜氨酸肽抗體形成中具有關鍵作用的肽酰基精氨酸脫亞胺酶(PADI)成為RA病因學研究的熱點。日本學者 Suzuki等［1］研究發現，PADI4基因padi4_94位點SNP與RA有很強的相關性，且該位點SNP可影響PADI4酶的產量，這提示PADI基因與RA的密切相關性，因此我們選擇 padi4_94位點作為研究對象，以探討PADI4基因在RA發病機制中的重要作用，同時檢測病例組的抗CCP抗體滴度，分析PADI4基因SNP與抗CCP抗體之間的相關性。

國內學者［2］對于 RA中醫證候與抗 CCP抗體的相關性研究發現，不同證候的RA患者中以濕熱阻絡型抗-CCP抗體最高，提示中醫分型具有分子水平的基礎。同時多個研究［3、4］表明，RA不同證候間的基因表達譜存在差異，該差異與RA患者和正常人之間有所不同，也與RA患者穩定期和活動期之間的基因表達譜不同，提示RA中醫證候分類學具有基因表達譜依據。因此，可影響功能基因表達的單核甘酸多態性也可能是中醫證候分類學的基礎。

目前認為，PADI4基因是抗CCP抗體形成的關節。PADI4作為PADI酶家族的一個亞型，都能將蛋白質肽鏈中的精氨酸殘基催化轉化為瓜氨酸殘基。目前PADI4與RA的相關性已獲得公認，其可能的機制是:PADI4mRNA在炎癥過程中浸潤到滑膜細胞的嗜中性粒細胞中迅速轉錄和翻譯，進而PADI4酶將滑膜中的蛋白催化產生瓜氨酸肽。這種瓜氨酸化使自身表位發生改變，外周淋巴細胞可以識別瓜氨酸化的自身表位，一旦針對一個自身蛋白修飾位點的自身免疫建立起來，免疫系統將識別自身抗原隱蔽的抗原決定簇，使自身抗原不斷受到新的攻擊，疾病遷延不愈并不斷加重。研究表明，在RA 滑液的巨噬細胞中有大量的表達［5］，Shi J 等［6］］的研究證明PADI4可以提高瓜氨酸化抗原肽的水平。這些研究證實了上述機制，且表明PADI4在類風濕關節炎患者抗瓜氨酸化抗原肽的形成中具有決定性的作用。

本研究結果顯示，padi4_94SNP位點與RA易感性之間存在相關性，A等位基因可能為RA的易感基因，這與日本的報道相一致，其基因型分布也與日本人群的基因型分布結果類似。但是關于PADI4SNP位點與RA易感性之間的關系并未獲得一致的結果，英國［7］、阿根廷［8］和一個法國［9］人群的研究提示了陰性結果。這些報道認為，PADI4基因SNP與RA無關，這可能與不同人群種族內的遺傳異質性有關。但即使在歐洲人群中的研究［10］也存在陽性的結果，提示種族的影響并不是導致差異的主要原因。另外，RA是一種復雜的多基因遺傳病，是由許多微小基因和環境因素共同作用導致的結果，在環境因素中，寒冷、潮濕、外傷等常為本病的誘發因素，因此PADI4基因只有在一定的環境因素下才可能對RA的發病存在易感性。由于各地區的環境因素不盡相同，因此可能導致不同地區的研究結果的不一致性。同時其他遺傳基因的變異也可能影響 PADI4基因對 RA的易感性，對 RA易感的PADI4功能型單倍體可能被其他基因中的某等位基因修飾。含有精氨酸或瓜氨酸的肽鏈可與HLADRB1的8個變異體相互作用，其中 HLA-DRB1*0401變異體對瓜氨酸化肽的免疫親和力最高，并激活CD4+T細胞，因此推測RA發病機制中 PADI4受到HLA-DRB1變異體的影響。多個研究結果提示，PADI4與HLA-DRB基因的連鎖可能是其影響類風濕關節炎易感性之的原因［11～13］。但不同種族之間的HLA基因具有差異，這可能導致了結果的不一致性。

我們隨后檢測了病例組抗CCP抗體的滴度，并分析了PADI4基因SNP與抗CCP抗體之間的相關性。研究認為，無論是應用滴度的連續變量分析方法，還是根據診斷閾值判定的二分類變量分析方法，都發現兩者之間存在相關性，攜帶RA易感等位基因A的患者抗CCP抗體的陽性率較高，且其抗CCP抗體的滴度相對較高，這與日本的研究一致。而我們的研究從DNA水平上驗證了Suzuki的觀點，這說明PADI4基因SNP影響基因表達，導致體內PADI4產生增多，進而導致蛋白質廣泛瓜氨酸化。

本文結果表明，PADI4基因是與河北漢族人群RA發病相關的一個易感基因，且PADI4基因與瓜氨酸化肽相關性的研究結果，為探索RA的發病機制提供了理論依據和新線索。進一步分析PADI4基因多態性與不同中醫證候型的類風濕關節炎關系，可能會發現更多中醫分析的理論基礎，為RA的治療開辟新的途徑。

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