利用熒光分析法測定玉米須中的總黃酮含量

曹葉霞，張海容，尹愛萍，何盛寶

（忻州師范學院化學系，山西 忻州 034000）

玉米須為禾本科玉蜀屬植物玉米（Zea mays L.）的花柱和柱頭，它含有多種化學成分，如揮發油、皂苷、生物堿、黃酮類、多聚戊糖、尿囊素、有機酸等。其味淡、性平，有利尿、泄熱、平肝、利膽之功效，可用于治療腎炎、膽結石、糖尿病、黃疸、麻疹、乳糜血尿、血崩等癥[1]。現代藥理研究證明，玉米須有顯著的利尿[2]、降血糖[3]、抑菌[4-5]、降壓、增強免疫[6]、抗癌[7]等功效。

玉米須是我國傳統的中藥材，全國各地均廣泛栽培玉米，因此，作為玉米副產物的玉米須資源十分豐富，但對它的開發利用非常有限，除少量入藥外，大部分被白白丟棄。鑒于玉米須既有明顯的藥理價值，又具備一定的食療特征，進行工業化開發利用前景相當廣闊。作為玉米須主要活性成分之一的黃酮類單體，國內至今尚未見報道，國外研究也不多。目前，測定食品及中草藥中黃酮類的方法有直接測定法、紫外測定法[8-11]、三氯化鋁比色法、硝酸鋁比色法[12]、HPLC法等。

為了尋求操作簡便、成本低、準確的檢測方法，本研究根據黃酮類化合物能與鋁離子形成穩定的熒光絡合物，提出采用熒光光度法測定總黃酮的含量[13]。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑

玉米須采于忻州市。將玉米須用蒸餾水洗凈，陰干，然后粉碎過篩，裝入試劑瓶待用。蘆丁標準品為北京化學試劑公司提供。

主要儀器:F-4500型熒光分光光度計（日本日立公司）、KQ-100DB型數控超聲清洗器（江蘇省昆山市超聲儀器有限公司）、AL204精密電子分析天平（上海梅特斯-托利多儀器有限公司）和SHZ-D（Ⅲ）循環水式真空泵（河南省鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的制備 精密稱取玉米須粉20.0000g置于100mL錐形瓶中，按料液比為1∶20加入60%乙醇溶液，在功率400 W下，超聲處理20 min，過濾，用60%乙醇定容至100 mL；然后從中吸取5 mL至25 mL的容量瓶中，用60%的乙醇定容；再從中吸取1 mL，置于25 mL比色管中，加入0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL和pH=5.3的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液6 mL，用60%乙醇定容，搖勻。

1.2.2 蘆丁標準溶液的制備 精密稱取蘆丁20.0 mg，用60%的乙醇溶解，定容于100 mL的容量瓶中，即配成質量濃度為0.2 mg/mL的標準溶液。準確吸取標準溶液 0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL分別置于25 mL比色管中，加入0.1 mol/L AlCl3溶液2 mL和pH=5.3的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液1 mL，用60%乙醇溶液定容、搖勻，即配成標準工作溶液。

1.2.3 測定 在激發光譜通帶5.0 nm，發射光譜通帶5.0 nm，激發波長λex=445 nm，發射波長λem=542 nm的條件下，測定蘆丁標準溶液的熒光強度。以熒光強度與相應的濃度作圖，繪制標準曲線。然后在相同條件下測定樣品中總黃酮的熒光強度，再用回歸方程求解其含量。

2 結果與分析

2.1 熒光化合物的激發及發射光譜

按實驗方法選擇光譜通帶寬度，對蘆丁標準溶液的激發及發射光譜進行掃描。所得激發及發射光譜如圖1所示，所得激發及發射光譜分別為445，542 nm。

2.2 測定條件的選擇

2.2.1 pH值 溶液的pH值影響絡合物的形成和熒光強度。在實驗中發現，當溶液呈酸性，pH=4.74～6.74時，溶液熒光強度最大（圖2）。所以，實驗中選擇加入pH=5.3的醋酸-醋酸鈉緩沖液。

2.2.2 AlCl3溶液用量 黃酮類化合物與鋁離子可生成穩定的熒光絡合物。本實驗考察了AlCl3的用量。實驗表明，用0.1 mol/LAlCl3溶液加入1～3 mL為宜，本實驗選擇AlCl3的加入量為2 mL。

2.2.3 靜置時間 將溶液靜置于室內避免陽光直射處，并控制不同時間測定蘆丁標準溶液的熒光強度（每10 min測1次），其熒光強度變化情況如圖3所示。從圖3可以看出，溶液熒光強度在100 min內基本保持穩定。

2.2.4 表面活性劑 在熒光的分析中，表面活性劑對熒光強度有增敏、增穩作用。本實驗考察了5種表面活性劑吐溫-80、十六烷基溴化銨、Op-10、十二烷基磺酸鈉和氯代十四烷基吡啶對熒光強度的影響。結果表明，Op-10、十六烷基溴化銨、十二烷基磺酸鈉和氯代十四烷基吡啶對本實驗中熒光強度測定結果影響不大，吐溫-80使熒光強度增強，但其本身也產生強熒光，對測定發生干擾，所以，本實驗不加表面活性劑。

2.2.5 常見的金屬離子對測定的干擾 結果表明，加入 100 倍的 K+，Na+，Ca+，Mg2+等陽離子對總黃酮的測定無影響；100倍的Ba2+對測定結果有一定的影響，100倍的Fe3+對測定的干擾較大。

2.3 校準曲線及方法的檢出限

實驗結果表明，蘆丁為0～0.04 mg/mL時，具有良好的線性回歸方程，即y=216.63x+137.93。式中，y表示熒光強度，x表示蘆丁的質量濃度（mg/mL），相關系數r=0.9997，熒光強度與相應的質量濃度線性顯著相關。對空白對照液進行11次平行測定，根據公式CL=3S/K計算，熒光光度法的檢出限為1.08×10-9mol/L。

2.4 樣品測定及回收率實驗

按上述實驗方法測定了玉米須中總黃酮含量，并對樣品溶液進行平行測定（n=6），結果如表1所示。

表1 玉米須中總黃酮含量

由表2可知，用熒光分析法測定玉米須中總黃酮含量的平均回收率為98.3%～100.8%，實驗結果說明該方法可行。

表2 樣品回收率實驗結果

3 結論

熒光光度法測定玉米須中總黃酮含量，檢出限達到1.08×10-9mol/L。該方法靈敏度高，其準確性、重現性、線性關系、穩定性均能達到科研和生產的要求，操作簡便，可廣泛應用于植物中總黃酮的測定。

本實驗采用熒光光度法測定玉米須中總黃酮的含量，考察了pH值、AlCl3用量、靜置時間、表面活性劑以及干擾因素對熒光強度的影響，提高了測定結果的準確性。

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