定點突變麻雞副黏病毒ZH-1株F基因及其鑒定

李紅麗，詹麗娥，王彩先，唐 娟，陸冰洋

（山西省農業科學院畜牧獸醫研究所，山西 太原 030032）

麻雞副黏病毒病是由雞新城疫病毒引起麻雞的一種高度接觸性傳染病。近年來，由于NDV強毒株和變異株的流行，使得傳統疫苗已不能控制其流行，構建同源高效低毒的弱毒疫苗株，已成為迫切需要[1-2]。

本試驗針對麻雞副黏病毒F蛋白的特點，定點突變麻雞副黏病毒ZH-1株F蛋白112，115，117位氨基酸密碼子，使突變后的F蛋白的裂解位點具有弱毒株的特點[3]，旨在為下一步通過反向遺傳技術構建麻雞副黏病毒ZH-1株弱毒株奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 質粒、受體菌

工程菌DH5α由山西省農業科學院畜牧獸醫研究所預防獸醫研究室保存，重組質粒pGF（麻雞副黏病毒ZH-1株F gene）由該研究室構建。

1.2 酶與試劑

DNA Markers，LATaq酶，限制性核酸內切酶（EcoRⅠ，HindⅢ）購自TaKaRa公司；DNA gel extraction Kit購自vitagene公司。

1.3 PCR引物的設計與合成

根據麻雞副黏病毒ZH-1株F基因序列[4]，采用PCR體外定點突變技術[5-7]，首先設計1對外側引物F1和F4，該對引物分別與模板DNA的5′末端、3′末端互補。然后再在突變處設計1對完全互補的引物F2和F3，互補處引物長度為18 bp，設計原則是引物F2和F3有2個互補的、并在相同部位具有相同堿基突變的區域。使用這種重疊PCR定點突變法，需要進行3輪PCR反應。其中，前2輪擴增形成2條有一端可彼此互補的雙鏈DNA片段，二者在其互補區段具有同樣的突變，第3輪PCR使這2條片段融合起來，形成完整的目的基因片段。突變引物為:

其中，F1和F4兩引物的5′端分別加上了EcoRⅠ和HindⅢ酶切位點，由斜體表示；F2和F3兩引物互補處由下劃線標注，突變堿基處由方框標注。

1.4 PCR擴增F變基因[8]

第1，2輪PCR以重組質粒pGF為模板，以引物F1和F2擴增F基因的前351堿基對區域，以引物F3和F4擴增F基因的后1326堿基對區域；第3輪PCR以前2輪PCR純化回收的產物等量加入作為模板，用引物F1和F4進行擴增，得到裂解位點發生3個氨基酸密碼子突變的F變基因。反應體系列于表1和表2。

表1 第1，2輪PCR擴增反應體系

表2 第3輪PCR擴增反應體系

PCR反應條件為:95℃預變性2 min；94℃變性 45 s，58 ℃退火 40 s，72 ℃延伸 2 min，30 個循環；72℃延伸10 min。將3段PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并回收純化。

1.5 F基因克隆、序列測定及分析[9]

將電泳檢測正確的目的片段與pGEM-T載體以體積比5∶1進行連接、轉化Ecoli DH5α，篩選出陽性克隆株，經酶切、PCR鑒定，目的基因已克隆入pGEM-T載體，陽性克隆菌株送上海生工生物工程公司測序。利用Blast及DNAStar軟件分析測序結果。

2 結果

2.1 PCR擴增結果

將重組質粒pGF分別由引物F1和F2，F3和F4，F1和F4經過第 1，2，3輪 PCR反應后，經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，分別得到1條長度為361，1336，1662 bp的基因帶，與試驗設計結果相符合（圖1）。

2.2 重組質粒的酶切鑒定

重組質粒pGEM-F變經EcoRⅠ和HindⅢ酶切后電泳，出現1條長約1.7 kb的基因帶和長約3.0 kb的pGEM-T載體帶（圖2）。

2.3 核苷酸序列及推導的氨基酸序列

酶切鑒定正確的陽性重組質粒經上海生工生物工程技術服務有限公司進行序列測定，對測序結果進行拼接，得到F變基因的核苷酸序列。擴增的F變基因核苷酸序列長度為1662 bp，編碼553個氨基酸。擴增的F變基因112，115，117位氨基酸密碼子均被突變，與弱毒株在該處的堿基序列相符，F變基因的其余堿基序列與F基因堿基序列相一致，即

3 討論

NDV屬于副黏病毒科成員，為單股負鏈分節段RNA病毒，基因組全長達到15186 bp或15192 bp，共編碼6種蛋白:核衣殼蛋白（NP）、基質蛋白（M）、融合蛋白（F）、血凝素-神經氨酸酶（HN）、大蛋白（L）、磷蛋白（P）[10]。F蛋白是禽副黏病毒感染細胞所必需的，它可促進病毒的囊膜與宿主細胞表面的脂蛋白膜融合[11]（又稱融合蛋白），使病毒穿入細胞漿脫去核衣殼進行復制。同時，F蛋白也是決定副黏病毒毒力的主要因素[12]。F蛋白首先合成無活性的F0前體形式，F0由蛋白酶水解為F1和一個較小的F2后，才能發揮F蛋白的融合作用。這種裂解取決于病毒毒株和宿主細胞的特性。裂解由宿主含有的蛋白酶完成，強毒株裂解位點兩側具有附加的堿性氨基酸，裂解可以由多種宿主蛋白酶完成，弱毒株裂解位點兩側不含有附加的堿性氨基酸，只能在含有類似胰蛋白酶的部位復制，例如呼吸道和腸道。因此，強毒株的F蛋白能在多種宿主細胞內裂解，使強毒株可在許多組織和器官中復制，對多種細胞具有感染力，導致致命的全身感染，而弱毒株的F蛋白只能在少數特殊類型的細胞中裂解，只對少數細胞具有感染力（臨床上表現為局部感染）。

F基因裂解位點區的氨基酸組成是新城疫病毒致病力的分子基礎。F蛋白的裂解位點在122位和117位氨基酸之間，強毒株為112Arg-Arg-Gln-Arg/Lys-Arg-Phe117，在Gln兩側各有1對堿性氨基酸，這對F0的有效裂解具有重要作用。弱毒株以中性氨基酸取代了強毒株中的堿性氨基酸，特別是112位和115位堿性氨基酸被取代，F0更不易裂解，它以非活性形式編入子代病毒中，從而喪失了病毒囊膜與宿主細胞表面的脂蛋白膜融合的活性，感染性很低。117位的氨基酸也是影響裂解的主要因素，強毒株為Phe，弱毒株為Leu；Phe雖不是裂解必需的，但轉變為Leu時卻能抑制裂解。

PCR反應的出現推動了定點突變的發展，以PCR為介導的定點突變技術為基因修飾、改造提供了一條重要途徑。通過改變引物中的某些堿基而改變基因序列，達到有目的地改造蛋白質的結構、研究蛋白質的結構和功能之間的關系的目的。重疊PCR延伸法是最經典的PCR介導的定點突變技術[13-14]，該方法利用PCR技術在體外進行有效基因重組和定點突變，且不需要內切酶消化和連接酶處理；該技術使用簡便，利用其可快速獲得其他依靠內切酶方法難以得到的產物。

麻雞副黏病毒ZH-1株屬于基因Ⅸ型NDV，其F蛋白裂解位點區（112～117 aa）的氨基酸序列為112Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Phe117，與強毒株在這一區域的序列相符。同時，依據國際上判定新城疫病毒毒力的標準，測定該毒株的雞胚平均死亡時間（MDT），腦內致病指數（ICPI）和靜脈接種致病指數（IVPI）分別為 69.6 h，1.66 和 1.65，雞胚最小致死量（MLD）為10-7，具有與新城疫病毒速發型相似的毒力，屬于強毒株。根據麻雞副黏病毒ZH-1株F蛋白與傳統新城疫弱毒株F蛋白的裂解特點，我們設計了此試驗對麻雞副黏病毒ZH-1株進行F基因定點突變，使表達的F蛋白在裂解位點處氨基酸的組成具有弱毒株裂解位點的特點。由于改變的3個氨基酸并不是影響F蛋白結構的主要因素，因此得到的F變基因編碼的蛋白與原F蛋白的抗原表位、疏水性、親水性以及糖基化幾乎完全保持一致。本研究為下一步構建麻雞副黏病毒ZH-1株弱毒株奠定了基礎。

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