羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊固定化蔗糖酶

楊 婷,侯文龍,牛少莉,劉曉敏,段志青,楊越冬

(河北科技師范學(xué)院理化學(xué)院,河北秦皇島,066004)

固定化酶是指被局限在某一特定區(qū)域上的、并且保留了它們的催化活力、可以反復(fù)、連續(xù)使用的酶。與游離酶相比,固定化酶具有下列優(yōu)點(diǎn):固定化酶極易與底物、產(chǎn)物分開(kāi);可以在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng);在大多數(shù)情況下,能夠提高酶的穩(wěn)定性;酶反應(yīng)過(guò)程能夠嚴(yán)格控制:產(chǎn)物溶液中沒(méi)有酶的殘留,簡(jiǎn)化了提純工藝;較游離酶更適合于多酶反應(yīng);可以增加產(chǎn)物的收率,提高產(chǎn)物的質(zhì)量;酶的使用效率提高,成本降低[1～7]。膠囊法固定化酶最接近自由酶的工作環(huán)境,能最大限度地保留酶的活性。在已有的膠囊法固定化酶技術(shù)中,利用聚陰離子電解質(zhì)——海藻酸和聚陽(yáng)離子電解質(zhì)——?dú)ぞ厶恰⒕圪?lài)氨酸等間的靜電作用形成多電解質(zhì)絡(luò)合物囊膜實(shí)現(xiàn)酶固定化的報(bào)道非常多[8～12]。羧甲基纖維素是非常廉價(jià)的聚陰離子電解質(zhì),也可與殼聚糖、聚賴(lài)氨酸等聚陽(yáng)離子電解質(zhì)形成多電解質(zhì)絡(luò)合膜實(shí)現(xiàn)酶的固定化,但以羧甲基纖維素和殼聚糖為原料進(jìn)行膠囊法固定酶的研究未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)以殼聚糖和羧甲基纖維素為原料制備羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊并用其固定蔗糖酶,考察羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊固定化蔗糖酶的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料和藥品

酵母;羧甲基纖維素鈉(化學(xué)純);殼聚糖(自制,脫乙酰度大于 80%);冰醋酸(分析純);無(wú)水乙醇(分析純);十二烷基硫酸鈉(SDS);葡萄糖(分析純);氫氧化鈉(分析純);3,5-二硝基水楊酸(化學(xué)純);蔗糖(分析純);醋酸鈉(分析純);丙三醇(分析純)等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊的制備 用 6號(hào)注射器的針頭將殼聚糖溶液滴入到 100mL的 CMC溶液中,硬化24 h后濾出,用 pH 4.6醋酸緩沖溶液洗滌后得羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊。實(shí)驗(yàn)中重點(diǎn)考察殼聚糖濃度、CMC濃度、硬化時(shí)間、固定化溫度對(duì)膠囊形成效果的影響。

1.2.2 蔗糖酶的制備 SDS(十二烷基硫酸鈉)抽提法[13]。稱(chēng)取酵母 10 g,加入 60 mL 0.3mmol/L的SDS溶解,40℃水浴 12 h后取出,4℃,12 000 r/min離心 15min,上清液即為粗制酶液。在粗制酶液中加入乙醇使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá) 0.30,4℃放置過(guò)夜,然后在 4℃下 12 000 r/min離心 15min,取上清液,追加乙醇使其終質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá) 0.50,4℃放置 1 h,在 4℃下 12 000 r/min離心 15m in,棄上清液,沉淀分為兩部分,一部分干燥后測(cè)定沉淀中粗酶含量;另一部分用 pH 4.6醋酸緩沖溶液配制成含粗酶 0.3%的酶液,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊固定化蔗糖酶的制備 取 1.2.2制備的粗酶液與 10.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.02的殼聚糖溶液充分混合,按 1.2.1相同的方法制備羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊固定化蔗糖酶。固定化蔗糖酶在 pH 4.6的醋酸緩沖溶液中,4℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊的表征 ①羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊形貌觀察:將膠囊用刀片切開(kāi)后平鋪在載玻片上晾干,用 SEM觀察膠囊表面形貌。②膠囊強(qiáng)度的測(cè)定:將膠囊置于離心管中,在 3 000轉(zhuǎn)/min離心 30 min后觀察膠囊的破碎或保持完整性情況來(lái)表征膠囊的膜強(qiáng)度。

1.2.5 酶和固定化酶活性的測(cè)定 以煮沸酶液作對(duì)照,以 1m in內(nèi)催化釋放 1μmol還原糖的酶量為 1個(gè)酶活單位(U)。取 2.0mL粗酶液與 2.0m L蔗糖溶液(0.2 g/L,pH 4.6醋酸溶液)混合均勻,于 37℃反應(yīng) 15 min。用 DNS法測(cè)定反應(yīng)液中還原糖的量[13～14]。固定化酶酶活測(cè)定同游離酶。取適量固定化酶與底物混合,均勻震蕩 15min后,取上清液用 DNS法測(cè)反應(yīng)液中還原糖的量。試驗(yàn)中重點(diǎn)考察緩沖溶液的 pH值、反應(yīng)溫度對(duì)游離酶和固化酶活性的影響。

游離酶和固定化酶的米氏常數(shù)通過(guò) Lineweaver-Burk作圖法(即雙倒數(shù)作圖法)測(cè)定。以 1/V對(duì) 1/[S]作圖,根據(jù)直線在橫軸上的截距(-1/Km)求出米氏常數(shù) Km。

2 結(jié)果與分析

2.1 膠囊形貌

膠囊的形貌表面的微細(xì)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。從圖 1可以看出,羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊球形規(guī)整,分散性好,粒徑均在 3mm左右(左上角 a為膠囊照片)。SEM觀察可以看出,膠囊表面較均勻地分布許多孔徑在 100～300 nm的微孔,這是反應(yīng)底物和產(chǎn)物能有效遷移通過(guò)囊膜的基礎(chǔ)。

2.2 影響膠囊形成的因素

2.2.1 殼聚糖和羧甲基纖維素濃度對(duì)膠囊形成的影響 將殼聚糖溶液和羧甲基纖維素溶液按不同的濃度組合制備膠囊,固化 24 h后觀察成球情況;再經(jīng) 3 000 r/m in離心半小時(shí)。當(dāng)殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02,CMC的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.015時(shí),制得的膠囊其成球性好,球形規(guī)則,機(jī)械強(qiáng)度最好,高于或低于此濃度時(shí)均不能得到理想的膠囊。

2.2.2 固定化時(shí)間對(duì)成球效果的影響 以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.02的殼聚糖溶液,質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.015的 CMC溶液制備膠囊,在室溫下固化不同時(shí)間,經(jīng) 3 000 r/min離心半小時(shí)后觀察膠囊的變形情況。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),隨著固化時(shí)間的延長(zhǎng),囊膜強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),固定化時(shí)間為 24 h后的囊膜強(qiáng)度基本不再變化,處理過(guò)程中不再有皺縮或粘連的現(xiàn)象。

2.3 固定化酶的性質(zhì)

2.3.1 pH值對(duì)固定化酶活性的影響 蔗糖酶在 pH 4.6時(shí)活性最大,試驗(yàn)中為考察固定化酶的耐酸堿性能,分別將游離酶和固定化酶在任意 pH值時(shí)的活性與各自在 pH 4.6時(shí)活性的比值的變化來(lái)表征游離酶或固定化酶活性受酸堿度的影響,測(cè)試溫度 40℃(圖2)。由圖 2可知,游離蔗糖酶在 pH 4.6～5.0范圍內(nèi)活性最高,偏離這一 pH值范圍其活性快速下降;當(dāng)體系的 pH 5.5時(shí)游離蔗糖酶的活性?xún)H為最高時(shí)的 18%,當(dāng) pH 3.6時(shí)其活性為最高時(shí)的 63%。而殼聚糖 -羧甲基纖維素膠囊固定化蔗糖酶的活性在 pH 4.6的偏酸性范圍內(nèi)隨酸度增加,活性只是略有減低。當(dāng) pH值高于 5.0后固定化酶的活性才明顯降低,但其幅度也明顯低于游離酶,說(shuō)明蔗糖酶固定化后其耐酸堿性能明顯提高。

2.3.2 固定化酶的最適溫度 體系的 pH 4.6時(shí),蔗糖酶在 50℃表現(xiàn)出最高的催化活性。游離蔗糖酶和羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊固定化蔗糖酶在不同溫度時(shí)相對(duì)于各自在 50℃的活性如圖 3所示。在低于 50℃時(shí),體系的溫度變化對(duì)游離蔗糖酶和固定化蔗糖酶的活性影響基本相同;高于 50℃時(shí),隨體系溫度升高,游離酶的失活作用明顯快于固定化酶,可見(jiàn)經(jīng)羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊包封后的蔗糖酶耐熱性能有明顯提高。

2.3.3 米氏常數(shù)(Km)與最大反應(yīng)速度 分別以不同濃度蔗糖溶液在 37℃,pH 4.6下測(cè)定酶活力,以1 min時(shí)測(cè)定的酶活力代表酶促反應(yīng)初速度,按 Lineweaver-Burk作圖法作圖(圖 4)。根據(jù)直線在橫軸上的截距(-1/Km)求出固定化酶的米氏常數(shù)(Km=54.11 mmol/L)較游離酶(Km=35.62mmol/L)大。這說(shuō)明固定化酶對(duì)底物的親和力相對(duì)較小,這與囊膜對(duì)底物和產(chǎn)物的擴(kuò)散限制有關(guān)。也正是基于此原因,試驗(yàn)中固定化酶中還原糖的最大反應(yīng)速度為 10.82mg/(m L·min),低于游離酶中的還原糖 Vmax=12.72 mg/(mL· min)。

圖 1 羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊表面的 SEM照片

圖 2 pH值對(duì)游離酶和固定化酶活力的影響

圖 3 溫度對(duì)游離酶和固定化酶活力的影響

圖 4 底物濃度與速率的關(guān)系

3 結(jié) 論

羧甲基纖維素-殼聚糖膠囊固定蔗糖酶耐酸性、耐熱性明顯增強(qiáng),固定化酶的米氏常數(shù)(Km=54.11 mmol/L)大于游離酶的米氏常數(shù)(Km=35.62mmol/L);制備固定化酶的最佳工藝為:將酶溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.02的殼聚糖溶液中,滴入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.015的羧甲基纖維素溶液中固化 24 h。

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(責(zé)任編輯:石瑞珍)