利用 16S-23S rDNA間隔區(qū)快速鑒定豬鏈球菌和馬鏈球菌獸疫亞種

劉廣錦,陳綿綿,商可心,范 潔,張 煒,姚火春,陸承平

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,江蘇南京,210095)

豬鏈球菌病(Porcine streptococcal disease)是由多種溶血性鏈球菌感染引起的豬的一種多型性病,包括急性型的敗血癥和慢性型的關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、淋巴結(jié)膿腫、哺乳仔豬下痢和孕豬流產(chǎn)等。通過流行病學(xué)調(diào)查,本病在我國各地均有發(fā)生,豬鏈球菌與馬鏈球菌獸疫亞種是我國豬源鏈球菌病的兩種主要病原[1]。豬鏈球菌(Streptococcus suis,S.suis)是 1987年由 Kilpper-Balz等提議建立的1個新種[2],能引起豬和其它家畜及人類的多種臨床疾病,按照其莢膜抗原的差異,目前分為 35個血清型(1-34,1/2)和相當(dāng)數(shù)量無法定型的菌株[2],其中豬鏈球菌 1型、1/2型、2型(S.suis serotype 2,SS2)、7型、9型屬于在世界上流行較廣的致病性血清型[3],對養(yǎng)豬業(yè)及公共衛(wèi)生均構(gòu)成嚴重威脅。馬鏈球菌獸疫亞種(Streptococcus equi subsp.zooepidemicus,S.zooepidemicus)屬于蘭氏分群的C群鏈球菌,其沒有宿主專嗜性,可感染牛、豬、猴子和羊[4～6],人類因食用污染的食物或與發(fā)病動物密切接觸后,亦可引發(fā)該菌感染[7,8],是一種重要的人獸共患病的病原。1977年四川地區(qū)發(fā)生過該病的大流行,造成 30多萬頭豬死亡,迄今為止仍呈地方流行[9]。因此,建立快速、敏感、特異的檢測方法來鑒別這兩種病原菌,對防制豬鏈球菌病具有重要作用。

在 16S rDNA與 23S rDNA之間,有一段連接序列,稱為 16S-23S rDNA間隔區(qū)(16S-23S rDNA gene intergenic spacer region,ISR),是非功能區(qū),所處的選擇壓力很小,進化速度是 16S rDNA的 10倍,Schlege等[10]報道了 ISR分析是一個鑒定鏈球菌屬內(nèi)的種(包括豬鏈球菌)的很有力的工具。因此,筆者就從 16S-23S rDNA ISR的高進化率特征入手設(shè)計引物,使用 PCR方法區(qū)分導(dǎo)致豬源鏈球菌病的兩種重要病原——豬鏈球菌 2型和馬鏈球菌獸疫亞種。

隨著當(dāng)前生物信息學(xué)的快速發(fā)展,許多重要的人畜共患病病原的全基因組序列和 16S rDNA,16S-23S rDNA ISR,23S rDNA序列都已公布,可以在美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)和英國基因組研究中心(Sanger)免費下載。同時,還可利用 NCBI中 Primer-BLAST功能,以 GenBank中收錄的大量核苷酸序列作為模板進行“虛擬 PCR”,為設(shè)計正確的 PCR引物和檢測引物的特異性提供了優(yōu)越的平臺。本實驗就是先下載大量序列進行分析比對,分別在 16S rDNA末端和 23S rDNA前端保守區(qū)設(shè)計了上下游引物,在Primer-BLAST中驗證引物的特異性,然后再進行PCR的操作,確保實驗的真實可靠性。通過PCR,發(fā)現(xiàn)實驗中的 21株豬鏈球菌均擴增出長度約為 1 100 bp的片段,8株馬鏈球菌獸疫亞種均擴出約1 300 bp的片段,其他屬菌株和陰性對照無結(jié)果。這樣,由PCR產(chǎn)物長度的不同就可快速區(qū)分豬鏈球菌和馬鏈球菌獸疫亞種。最后,將代表株(HA9801,ATCC 35246)的PCR產(chǎn)物進行測序,進一步驗證了實驗的準確性,同時也發(fā)現(xiàn)豬鏈球菌和馬鏈球菌獸疫亞種 ISR最大的差異表現(xiàn)為豬鏈球菌有一段 172 bp基因的缺失。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 本實驗室保存的12株豬鏈球菌 2型;6株豬鏈球菌9型;豬鏈球菌 1型,1/2型,7型各 1株;8株馬鏈球菌獸疫亞種;其他菌株:金黃色葡萄球菌,大腸桿菌Top10,嗜水氣單胞菌 W 1,嗜水氣單胞菌 J1。共 33株細菌(表 1)。

表 1 菌株列表

1.1.2 試劑 PCR Mix,200 bp DNA Ladder Marker和細菌DNA抽提試劑盒和 PCR產(chǎn)物回收試劑盒為TIANGEN產(chǎn)品;pMD19-T連接載體,DL2000Marker購自 Takara公司;核酸染料Goldview購自賽百盛生物科技公司;THB培養(yǎng)基為美國BD公司出品;PCR儀采用Biometra公司產(chǎn)品,凝膠成像系統(tǒng)出品于 Bio-RAD。

1.1.3 引物 本次研究利用 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)和 Sanger(www.sanger.ac.uk)中心上公布的基因序列,下載豬鏈球菌中 3株(05ZYH 33,98HAH 33,P1/7)已完全測序的全基因組序列,7株豬鏈球菌 2型和 3株馬鏈球菌獸疫亞種的 16S-23S rDNA間隔區(qū)序列,在 DNASTAR軟件 MegAlign中進行基因比對,使用Primer Prem ier 5.0結(jié)合 Oligo 6.0引物設(shè)計軟件分別在 16S rDNA的 3'端和 23S rDNA 5'端保守區(qū)設(shè)計上下游引物,擴增 16S-23S rDNA ISR完整序列,擴增片斷長度約為1 100～1 300bp。上下游引物序列分別為KISR1:5'-AAG CCA GTC TCA GTT CG-3';K-ISR 2:5'-TAG GGT TGG GAG ATG GT-3'。

1.2 方法

1.2.1 細菌 DNA的提取 金黃色葡萄球菌、大腸桿菌 Top 10,嗜水氣單胞菌W 1,J1株接種于LB培養(yǎng)基,其余鏈球菌均接種于 THB培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)過夜后按TIANGENE公司細菌(革蘭氏陽性菌或陰性菌)基因組DNA提取試劑盒操作說明進行抽提。DNA樣品 -20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR反應(yīng) PCR反應(yīng)在 25μL體系中進行,2×PCR Mix 12.5μL,ddH2O 9.5μL,細菌 DNA樣品 1 μL,引物各 1μL。PCR循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性 5min;然后 94℃ 1min,50℃ 30 s,72℃ 1.5m in,循環(huán)擴增30次;最后 72℃延伸 10min,于 4℃結(jié)束反應(yīng)。

1.2.3 PCR產(chǎn)物電泳及回收 配制含Goldwiew的瓊脂糖質(zhì)量濃度為 10 g/L的凝膠,5 V/cm條件下電泳30min后,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察條帶,按 TIANGENE公司 PCR產(chǎn)物回收試劑盒說明對HA9801,ATCC 35246兩個樣品進行 PCR產(chǎn)物回收,準備連接PMD19-T載體。

1.3 基因克隆與鑒定

1.3.1 感受態(tài)細胞的制備 接種活力菌E.coliTop10置 37℃搖床上 200 r/min震搖培養(yǎng) 2～3 h,測得菌液 OD590約為0.375。拿出菌液在冰上放置 10m in使之停止生長,吸取 1.5mL菌液于EP管中,4℃ 5 000 r/m in離心 10min,棄去上清,在沉淀中加入預(yù)冷的 0.1mol/L CaCl2600μL,輕懸菌體,在冰上放置 30min。然后,再次 4℃ 5 000 r/min離心 10 m in,棄去上清,在沉淀中加入預(yù)冷的 0.1mol/L CaCl2200μL,輕輕重懸菌體,4℃存放 12 h后進行轉(zhuǎn)化。

1.3.2 目的基因連接 T載體 利用T-A連接,將純化的PCR產(chǎn)物直接連接于pMD19-T載體中,連接體系為:Solution I 5 μL,PCR回收產(chǎn)物 4μL,PMD 19-T載體 1μL。16℃水浴 1 h后轉(zhuǎn)化到 Top10感受態(tài)細胞中。

1.3.3 轉(zhuǎn)化 取連接產(chǎn)物4μL,感受態(tài)細胞 200μL混合均勻,冰上放置 30min。42℃水浴熱休克 90 s后,迅速取出放置冰上 2min。向混合液中加入新鮮 LB培養(yǎng)液 800μL,置 37℃搖床上 100 r/m in震搖培養(yǎng) 1h,4 000 r/min離心 5min。棄去 800μL上清,用剩余的液體重懸菌體,涂布含有 Amp的抗生素平板,置 37℃溫箱培養(yǎng)過夜。

1.3.4 鑒定 挑選單菌落,接于含有 Amp的 LB培養(yǎng)基培養(yǎng) 6 h,進行 PCR鑒定,確定已連接到pMD19-T載體中。

1.3.5 測序及序列分析 挑選HA 9801,ATCC 35246菌株的陽性克隆送上海英駿生物工程公司進行測序。使用 NCBI中的 BLAST功能與 GenBank中收錄的核苷酸序列進行同源性分析,并利用DNASTAR分析軟件將測序所得 2株細菌的基因核苷酸序列進行比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴增結(jié)果

以提取的各株細菌基因組為模板,以 K-ISR1和 K-ISR2為引物擴增,所有各型豬鏈球菌的擴增片斷均相同,約為1 100 bp,8株馬鏈球菌獸疫亞種擴增的片段也均在大約 1 300bp,這樣在片斷長度上就區(qū)分了豬鏈球菌和馬鏈球菌獸疫亞種。其他菌株和陰性對照均無結(jié)果(圖 1～圖 3)。

2.2 測序結(jié)果

挑選 HA 9801,ATCC 35246菌株的陽性克隆經(jīng) DNA雙向測序后,與 GenBank上相關(guān)序列(CP000408,DQ204516)比較,同源性分別為 99%,100%,進一步確定了實驗的準確性。在 DNASTAR軟件MegAlign中將 HA 9801,ATCC 35246進行基因比對,結(jié)果見圖 4。

圖 1 SS2和 S.zooepidemicus為模板的 PCR擴增結(jié)果

圖 2 SS9和其他屬細菌為模板的PCR擴增結(jié)果

圖 3 SS1,SS1/2,SS7和S.zooepidemicus為模版的 PCR擴增結(jié)果

圖 4 HA 9801和 ATCC 35246序列比對結(jié)果

續(xù)圖 4 HA 9801和 ATCC 35246序列比對結(jié)果

截去 16S rDNA末端和 23S rDNA前端的保守區(qū),16S-23S rDNA ISR完整序列由第 294 bp至 892 bp,長度分別為:HA9801=423 bp,ATCC 352465=595bp。 2株菌的 16S-23S rDNA ISR均只編碼 1個 tRNAAla基因,在 tRNAAla基因前序列變化不大,但HA 9801比ATCC 35246缺失了約 172個堿基。tRNAAla序列基本一致,在 tRNAAla基因之后基因插入和突變較多。

2.3 Primer-BLAST

利用 Primer-BLAST功能,將使用的引物在 NCBI中進行虛擬 PCR,K-ISR1與 K-ISR2這對引物還與肺炎鏈球菌 CGSP14株同源性為 100%,但預(yù)計擴增片斷大小約在 940 bp,從長度上與豬鏈球菌和馬鏈球菌獸疫亞種有明顯區(qū)別。

3 討 論

關(guān)于細菌的分類鑒定標(biāo)準很多,常見的細菌分類方法有表型(phenotype)分型法和基因(genotype)分型法[11]。表型分型法中有生化分型法、血清分型法、抗菌譜分型法、莢膜分型法和噬菌體分型法等。其中的一些方法操作較簡單,臨床結(jié)合密切,被廣泛應(yīng)用,但多有粗糙、費時費力,不能夠較好的區(qū)分流行菌株及散發(fā)菌株,強毒株與弱毒株。例如根據(jù)莢膜抗原的差異將 S.suis分為 35個血清型,但仍有相當(dāng)數(shù)量無法定型的菌株,且莢膜血清型并不能反映菌株的毒力。此外,S.suis生化特性很不穩(wěn)定,生化培養(yǎng)法常無法準確地定型而出現(xiàn)假陰性。隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展,基因分型法逐漸在細菌分類中占有主導(dǎo)地位,在S.suis中主要有核糖體基因法、聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法、隨機擴增核酸片段多態(tài)性分析(RAPD)[12],脈沖場電泳(PFGE)[13]、擴增片斷長度多態(tài)性(AFLP)[14]、基因測序等。每種方法分類的范圍不同,RAPD,PFGE,AFLP等多用于確定種屬的菌株分型鑒定,區(qū)分率高,但數(shù)據(jù)分析量大,需要借助計算機,費時費力,儀器也較昂貴。

趙冉等[15]針對 SS2毒力因子基因溶菌酶釋放蛋白(MRP)、胞外因子(EF)、豬溶血素(SLY)設(shè)計三重引物進行多重PCR擴增,建立了 SS2強毒株的 PCR鑒定方法,但多重 PCR試驗操作和反應(yīng)條件的優(yōu)化較為復(fù)雜。有文獻研究表明[16],某些SS2沒有這些毒力基因卻一樣具有致病性,有關(guān)的致病機理還有待于研究,且其他型的發(fā)病率也在不斷上升。范紅結(jié)等[17]根據(jù)S.zooepidemicus的毒力因子類M蛋白來鑒定菌株,但并未見用 16S-23S rDNA ISR來同時鑒別S.suis和 S.zooepidemicus的報道。由于 16S rDNA基因分子結(jié)構(gòu)上的高度保守性、分布的普遍性及其所含的大量信息,使16S rDNA基因成為了一個較為理想的基因分類靶序列,但是不同種鏈球菌的 16S rRNA核苷酸的不同主要集中在某一個很小的高變區(qū)[18]。23S rDNA分子與 16S rDNA一樣具有高度保守性,Harland等[19]利用 23S rDNA進行乳房鏈球菌和副乳房鏈球菌的鑒定,但 23S rDNA相對分子量較大,其基因數(shù)據(jù)庫也不如16S rDNA齊全。本次試驗利用16S-23S rDNA ISR長度和序列的多態(tài)性,結(jié)合16S rDNA和 23S rDNA的保守性,分別在 16S rDNA末端和 23S rDNA前端保守區(qū)設(shè)計上下游引物,巧妙地在序列長度上區(qū)分了S.suis和S.zooepidemicus,結(jié)果可直接在PCR核酸電泳圖中看到,達到了快速鑒定兩種病原的目的。

對 HA 9801和ATCC 35246的測序結(jié)果可見,堿基的插入造成了 16S-23S rDNA ISR長度的多態(tài)性。16S-23S rDNA ISR序列在編碼 tRNAAla基因序列之前,HA 9801比 ATCC 35246缺失了約172個堿基,在 NCBI中 BLAST發(fā)現(xiàn)此缺失部分是馬鏈球菌獸疫亞種特有序列,說明此部分反映了種間的差異,也為設(shè)計馬鏈球菌獸疫亞種的鑒定引物提供了基礎(chǔ)。兩株代表菌的 tRNAAla基因序列完全一致,這與 Brain等[20]提出 16S-23S rDNA ISR的 tRNAAla基因序列在鏈球菌屬中較為保守的結(jié)論相一致。在對其他細菌的16S-23S rDNA ISR研究中發(fā)現(xiàn),革蘭氏陽性細菌多編碼 tRNAAla或 tRNAIla基因,革蘭氏陰性菌根據(jù) ISR的片斷長短不等編碼 tRNAAla,tRNAGla,tRNALla,tRNAVla,tRNAIla,還有部分 ISR根本不含tRNA基因[21～23]。在編碼tRNAAla基因序列之后二株菌表現(xiàn)出較多堿基的不同,作為可變區(qū)。

在進行本試驗前,從NCBI和Sanger中心下載了大量的基因序列,在比對中發(fā)現(xiàn),rDNA在許多細菌基因組中都是有多個拷貝,說明rDNA在基因組中占有重要地位。同時拷貝數(shù)也不盡相同,如在豬鏈球菌,肺炎鏈球菌中是 4個,化膿鏈球菌中為 6個,嗜熱鏈球菌則達到 7個。

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(責(zé)任編輯:朱寶昌)