柑橘中冷脅迫相關的m iRNA的RT-PCR鑒定

張金梅，李 煌，汪啟明，饒力群

（湖南農業大學生物化學與分子生物學研究室，湖南長沙 410128）

MiRNA是一類長約 21～22 nt的內源單鏈RNA，不具有開放閱讀框。成熟的miRNA 5′端有磷酸基團，3′端有羥基。miRNA本身不編碼蛋白質，但能協調許多基因的表達，通過切割靶基因的或抑制其翻譯[1]，調節植物的激素分泌和信號轉導，增強植物對惡劣環境的適應能力[2-5]。此外，植物miRNA還具有保守性、時序性和組織特異性[6-7]，在個體發育的不同時期或不同組織中有不同的表達模式。

利用微陣列技術從水稻中識別了18個冷脅迫反應miRNAs，大多數的表達是下調。其中miRNA167和miRNA319的表達模式相似，miRNA171家族的不同成員表達模式各不相同，呈現出多樣性[8]。采用全基因組分析和高通量測序技術，鑒定了短柄草中多個miRNAs，其中28個miRNAs對冷脅迫反應明顯，所有的27個保守的miRNAs都受冷脅迫表達上調[9]。但關于柑橘中miRNAs的功能尤其是與冷脅迫的相關性卻是空白，盡管已在柑橘中發現27個miRNAs[10]。本研究以柑橘為材料，4℃冷脅迫處理不同時間，提取葉片中總RNA,進行逆轉錄合成cDNA，再用半定量RT-PCR擴增，以確定這幾個miRNAs在柑橘中是否存在及經冷脅迫處理不同時間后的差異表達情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 供試柑橘品種為金橘，種植于湖南農業大學日光溫室中，常規栽培管理。將金橘置4℃條件下光照培養箱中冷處理，于 0、0.5、4、8 h 和14 d分別取其幼嫩葉片，-80℃中保存。

1.1.2 儀器與試劑 （1）儀器：高速冷凍離心機、微型離心機、研缽 、烘箱、制冰機、高壓蒸汽滅菌鍋、移液器、電泳儀、凝膠成像分析儀、紫外分光光度計、PCR儀、梯度PCR儀；（2）主要試劑：Trizol（In－vitrogen）、氯仿、異丙醇、DEPC 滅菌水、70%乙醇、逆轉錄酶 M-MLV；RNasin（40 U/μL）、dNTP（2.5 mM/L）、Taq DNA 聚合酶（5 U/μL）、pGM-T 克隆試劑盒、重組菌落PCR鑒定試劑盒。

1.2 方法

1.2.1 引物合成 引物采用PrimerPremier 5.0軟件設計，由上海生工生物技術有限公司合成。所用引物序列如下表1。

表1 所用引物序列

1.2.2 總RNA的提取與質量檢測 提取不同時間處理過的金橘葉片中總RNA。先將離心機預冷至4℃，研缽和離心管用液氮預冷，迅速將葉片于研缽中液氮研磨成粉，加到1.5 mL的離心管中，向每個離心管中加入lmL Trizol，振蕩混勻，室溫靜置5 min，12 000 r/min離心10 min。取上清液到另一干凈離心管中，每個離心管中加入200μL氯仿劇烈振蕩，冰上靜置5 min，12 000 r/min離心10min。取上清液到另一干凈離心管中，加入等體積的異丙醇沉淀10 min，13 000 r/min離心12 min。去上清，用70%乙醇洗滌沉淀，12 000 r/min離心2 min。去上清，沉淀，室溫中晾干，加入DEPC水中于-80°C保存。

取5μL DEPC滅菌水溶解RNA后點樣，1.5%瓊脂糖凝膠在80V/穩壓下電泳30 min，進行RNA完整性檢測。再用紫外分光光度計測得OD260/OD280為1.93，說明此RNA純度很高；濃度為340μg/mL，含量高，適合做RT-PCR。

1.2.3 半定量RT-PCR對不同時間冷脅迫下柑橘中m iRNA的差異表達鑒定 （1）PCR循環數的確定：PCR反應中，產物最初為指數增加，當Taq DNA酶活力不足或反應試劑有限時，擴增產物量會達到飽和。此時，不同濃度的cDNA做模板，產物量會相同。故只有產物量未到平臺期的循環數，才能有效檢測擴增前各基因的起始濃度。在22～30個范圍內設置了4種不同的循環數，以確定目的基因的最佳PCR反應循環數，最后確定為miRNA156、miRNA166a、miRNA167d 為 25，miRNA166 為 22，miRNA171為28。

（2）PCR體系的優化：為了提高PCR的特異性，又能獲得較多的產物，需優化PCR體系的引物量。將預先配好的12.5 mM的引物，分別取不同的量，梯度設置為：0.5、0.8、1、1.2 、1.5 μL，然后根據 PCR產物電泳結果選用合適的引物量，實驗選定為1 μL。為了取得最佳效果，對退火溫度進行優化。以引物合成報告單上的退火溫度低5℃為參照，上下2°設置4個溫度梯度，根據PCR產物電泳結果，確定最佳退火溫度為56℃。

（3）逆轉錄：miRNA 前體帶有 poly（A）尾，可用Oligd（T）進行逆轉錄。對 miRNA167a、miRNA167d和miRNA171采用此法。取純化后的總RNA按下列步驟進行:反轉錄反應體系（20μL）：在RNasefree 0.2 mL離心管中配制下列反應液Total RNA 1～5 μg，Oligo（dT15）Primer（12.5 μM）2 μL，加RNase free H2O到10μL，簡短離心混勻，70℃溫育5 min，冰上急冷3 min。上述反應液10μL中加RNase Inhibitor（40 U/μL）1 μL，5×PrimerScriptTM Buffer 4 μL，M-MLV（200 U/μL）1 μL，dNTPMixture（2.5 mM）4μL總體積 20μL。混勻，42℃，60 min，70℃，15min，-20℃保存備用。

miRNA成熟體由于序列長度太短，極易降解，在細胞內含量又極其低微，以Oligd（T）為引物很難檢測到。故設計基因特異性的莖環引物做逆轉錄，再進行PCR擴增。

Stem－loop RT-PCR是一種高效、靈敏特異的小分子miRNA的檢測方法[11-12]，已在多種植物的miRNA檢測中獲得成功[13-14]。對miRNA156和miRNA166采用Stem-loop RT法，純化后的總RNA反轉錄合成cDNA。反應步驟：總RNA 1～5μg，特異莖環引物（12.5 μM）2 μL，dNTP Mixture（2.5 mM）4μL，RNase free H2O 4μL。用槍輕輕吹打混勻，70℃溫育5min，冰上急冷5min。在上述反應管中配制下列反轉錄反應液。加入RNase Inhibitor（40 U/μL）1 μL，5 ×First strand Buffer 4 μL，M-MLV（200 U/μL）1 μL，dNTPs 4 μL，總反應體系 20 μL。混勻，16°C 30min；30℃ 30 s，42℃ 30 s，50℃ 1 s；85℃10min完成逆轉錄反應，-20℃保存。

（4）PCR反應：以上述合成的cDNA為模板，PCR反應擴增目的基因，分別以EF和U6為內參基因平衡cDNA模板濃度。20μL的PCR反應體系中含 cDNA 2μL，上下游引物（12.5μM）各 1μL，dNTP Mixture（2.5 mM）4 μL，PCR Buffer 2 μL，DNA polymerase 0.35 μL，補 ddH2O 至 20 μL，混勻，按照以下程序進行擴增:94℃變性5min；94℃變性 30 s，56℃退火 30 s，72℃延伸 1min，25 個循環；然后72℃保持5min。將上述RT-PCR產物在1.5%的瓊脂糖凝膠中點樣，在電壓80 V的TAE緩沖液中電泳20min，取出凝膠，紫外成像后，比較條帶強弱，確定miRNA基因在不同時間冷處理時的表達情況。

1.2.4 序列測定 擴增的目的基因產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，按說明書進行回收。用10 μL無菌ddH2O溶解已純化的回收片段，通過紫外分光光度計測定濃度，確定DNA與PGM-T載體的連接比例。將TOP10感受態細胞放置冰上，完全溶解后，輕輕將細胞混勻。吸取5μL的重組反應產物加入到50μL感受態細胞中，輕輕混勻，冰上放置30min。42℃熱激90 s，冰上放置3min。加入450 mL 37℃的LB液體培養基，37℃振蕩培養1 h。將大腸桿菌涂布在含有氨芐青霉素和IPTG和XGal的LB平板上，37℃倒置培養過夜。挑選圓且亮的白色菌落，加LB液體培養基做菌落擴大培養后，保存在1.5 mL EP管中，EP管中預先加入1 mL的LB液體培養基和15%的甘油和適量的氨芐青霉素混勻，送上海生工測序。

2 結果與分析

2.1 RNA提取結果

如圖1所示，出現三條主帶（28SrRNA、18Sr－RNA、5SrRNA），且 28SrRNA條帶的亮度約為18SrRNA條帶亮度的2倍，表明所提取的RNA較完整。

2.2 半定量RT-PCR對miRNAs的差異表達鑒定結果

如圖2、圖3所示，3種miRNAs前體（miRNAs167a、miRNAs167d、miRNAs171） 和 2 種 miRNAs的成熟體均被檢測到，說明了半定量RT-PCR對柑橘中miRNAs鑒定的可行性及stem loop RTPCT對小分子miRNAs的檢測具有高效性和靈敏性。實驗鑒定了5種柑橘miRNA在不同時間冷脅迫處理后的差異表達情況，隨著冷處理時間的延長，miRNA156和 miRNA171的表達量逐漸增加，而miRNA166的表達量在8 h內幾乎沒什么變化，經過14 d的冷馴化后，略有減弱。miRNA167a和miRNA167d的變化趨勢一致，先是表達量下降，8 h時出現回升，長期冷馴化后，呈下調趨勢。除miRNA166外，其余4個被檢測的miRNAs均在4℃冷脅迫0.5 h后反應明顯。

2.3 測序結果

miRNA156、miRNA167a、miRNA167d 及 miRNA171的測序結果與預測相符，miRNA166雙向測序后發現有重疊現象，懷疑是質粒模板本身與使用的引物之間存在多個結合位點，導致測序過程中擴增出多套模板。可能是由于miRNA166逆轉錄時使用的是具有發夾結構的莖環引物，發夾結構的互補序列均可與引物結合所致。

3 結論與討論

實驗鑒定了5個柑橘miRNA，并發現它們在4℃冷處理不同時間時各個miRNA的差異表達情況及其表達模式。關于冷脅迫的研究多在模式植物擬南芥中進行，這種抗寒性miRNA在植物中保守存在[15]。本研究也表明miRNA在擬南芥和柑橘中具有保守性。不僅在序列結構上是保守的，而且在功能上也是高度保守的。不同的miRNA在植物體內的表達差異顯著，在冷脅迫下參與基因表達調控，以應對逆境刺激。不同的miRNA對基因表達的調控模式不同，并隨時間變化。

以前對植物冷脅迫后miRNAs的表達研究時間很少有超過24 h，本研究設計了2周的冷馴化處理并觀察了處理后的miRNAs的表達量的變化。但對這些miRNAs是如何感受溫度變化，又是如何通過其靶基因來將信號整合進低溫調節網絡并提高柑橘的冷適應能力還不清楚。本研究以冷脅迫為切入點，其研究策略對于其他的脅迫反應如干旱、鹽堿等脅迫環境中miRNA的研究具有一定的指導意義。

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