煙草根系腐解液對萵苣的化感作用

牛麗娜，周冀衡，柳 均

（湖南農業大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128）

植物化感作用（Allelopathy）又稱植物生化他感作用或他感作用，是指植物在生長發育過程中，通過排出體外的代謝產物改變其周圍的微生態環境，從而產生的植物自身與其他有機體之間在同一生長環境中相互排斥或促進的一種自然現象[1-2]。煙草屬于不耐連作的作物。長期以來，連作障礙給煙葉生產帶來的危害十分嚴重，已成為影響和制約我國優質煙草生產的重要問題[3]。研究顯示，化感作用是引起煙草連作障礙的重要因素。因此，解決煙草連作障礙的一個重要研究內容，就是克服化感物質對煙草的影響。當土壤中具有一定濃度的化感物質后，可能對下茬作物的種子萌發和幼苗生長產生明顯的抑制作用。研究表明[1,4-5]，植物大部分有效化感物質是通過殘體和殘茬腐解釋放的次生代謝物質。煙草生產過程中，埋在地下的根系部分，受到土壤表層較高濕度及較少光照的影響，很容易腐爛分解，殘留在田間。煙草根系腐解后的產物是否會在田間形成化感物質，從而對煙草的生長發育產生不利影響，尚未見報道。本文以萵苣種子作為受體材料，研究探討了煙草生長殘留的根系腐解液對萵苣種子的化感作用，希望為進一步克服煙草生產中的連作障礙提供理論和試驗依據。

1 材料與方法

1.1 煙草凋萎根系早期腐解液的制備

參照廖周瑜等的方法[6]，取湖南農業大學耘園煙草種植基地的0～20 cm表層土壤，去除雜質，風干后碾碎過60目篩，土樣備用。采集煙草K326（Nicotiana tobacumL.K326）無病斑凋萎根系足量，風干后剪碎，隨機稱取兩份25 g樣品，紫外線殺菌3 h后，加入25 g上述土樣混勻，再加少許無菌水，置入250 mL三角瓶中于28℃培養箱內遮光腐解；45 d后，加入適量的無菌水提取48 h，經過抽濾，蒸餾水定容至250 mL，得質量濃度為0.100 g/mL的煙草凋萎根系早期腐解液。

取部分腐解液，用無菌去離子水分別稀釋至質量濃度為0.050 g/mL、0.010 g/mL和0.005 g/mL 3個濃度梯度。對照組為無菌去離子水。

1.2 煙草凋萎根系早期腐解液各組分的分離制備

按照郭亞利等的方法[7]，將上述0.100 g/mL濃度的腐解液離心（4 000 r/min，20 min），取 100 mL上清液用0.10 mol/L NaOH調節pH值至11.0，用等體積的無水乙醚萃取3次，收集上層乙醚相，經真空旋轉蒸發后，用去離子水定容至100 mL即為濃度FW（鮮質量）0.100 g/mL堿溶性組分。剩下的水相再用0.10 mol/L HCl調節pH至2.0后，再用等體積的無水乙醚萃取3次，真空旋轉蒸發后，用去離子水定容至100mL即為0.100 g/mL酸溶性組分；剩下的水相再用0.10mol/L NaOH調節pH值到7.0，用相同的方法得到中性組分。分別置于4℃保存備用。

取上述各組分液分別用無菌去離子水稀釋至0.050 g/mL、0.010 g/mL和0.005 g/mL 3個濃度梯度。共得4個濃度梯度組成的3種組分的處理液。

1.3 試驗設計與生物活性檢測

1.3.1 生物活性檢測裝置的改進 試驗中萵苣種子生長迅速，一般的培養皿空間較難滿足其生長的需要，因此對培養皿做了改進：超凈工作臺下，選取兩個相同規格的無菌培養皿皿蓋或皿盤，使選取的皿蓋/皿盤能組合配套。其中一個皿蓋/皿盤內鋪有殺菌后的雙層濾紙。將萵苣種子均勻播種于雙層濾紙上，然后均勻加入目標溶液，再將對應的皿蓋/皿盤蓋于播好種的皿蓋/皿盤上，用殺菌后的透明膠帶封閉兩皿蓋/皿盤間的縫隙，使其形成無菌環境，最后將其置于光照培養箱內培養。

1.3.2 生物活性檢測 采用培養皿濾紙法[8-11]進行生物活性檢測。實驗前，將培養皿及定性濾紙置于烘箱內120℃消毒滅菌2～4 h。

選取均勻飽滿的萵苣種子，用10%的次氯酸鈉溶液殺菌10min，用無菌水清洗3次，晾干備用。將消毒后的萵苣種子均勻播入上述處理的鋪有雙層濾紙的培養皿紙床上，每皿放置25粒，分別加入上述煙草凋萎根系早期腐解液及其不同組分4個濃度的提取液5mL，對照組加入5mL的無菌去離子水，3次重復。光照培養箱內（光強6 000 lx，光照12 h/d，濕度50%，箱溫恒定25℃）培養。每隔24 h觀察種子萌發狀況，以子葉露出或胚根長度≥1 mm為萌發標準，7 d后統計種子最終萌發率，并測定各處理萌發種子幼苗的胚根長、胚軸長及其鮮重和干重[12-13]。

1.4 數據分析及化感潛力評價

采用Microsoft Excel 2003及SPSS 15.0統計分析軟件進行數據統計分析。生物活性檢測試驗計算公式參照 Saxena等[14]的方法，見式（1）~式（4）。

上式中，GR表示種子萌發率，G表示種子萌發數；RG表示種子萌發速率；Di表示天數，Ni表示第i天的發芽數；MPUG表示平均萌發周期；UG表示最終萌發率，即試驗過程中，最大平均種子萌發率；PI表示種子萌發抑制率，PS表示種子萌發促進率，UG（CK）表示對照組處理后的最終萌發率，UG（AE）表示經處理后的最終萌發率。

化感效應指數（RI）采用Williamson[15]的方法，見式（5）。

式中，C為對照值，T為處理值。當RI＞0時，表示促進作用；當RI＜0時，表示抑制作用。

2 結果分析

2.1 煙草凋萎根腐解液及其組分對萵苣種子萌發的影響

對照組的最終萌發率為（98.67±2.31）%。除腐解原液和中性組分的0.005 g/mL處理組未降低萵苣種子的最終萌發率外，煙根腐解原液及其組分各濃度處理均降低了萵苣種子的最終萌發率（表1）。隨著煙根腐解原液、中性組分各處理濃度的增加，萵苣種子最終萌發率逐漸降低。其中，中性組分0.100 g/mL處理中萵苣種子的最終萌發率與對照組達到極顯著差異水平。酸溶性組分各濃度處理對萵苣種子最終萌發率的影響呈現單峰現象，即中間濃度處理的萵苣種子最終發芽率較兩端濃度處理的高。堿溶性組分的影響規律不明顯。4種組分處理內，各濃度間，腐解原液、酸溶性組分差異不顯著；中性組分3組低濃度處理差異不顯著，但0.100 g/mL處理組與這3組差異極顯著；堿溶性組分除0.100 g/mL處理組與其他3濃度處理組差異顯著外，其他3組差異不顯著。4組處理液條件下，煙根腐解原液及其組分各濃度處理對萵苣種子的萌發均呈現抑制作用，其抑制效應與對萵苣種子最終萌發率的影響規律相似，其中腐解原液和中性組分的0.005 g/mL處理組對萵苣種子的萌發并沒有抑制作用。

表1 煙根腐解液及其組分對萵苣種子萌發參數的影響

煙根腐解原液及其組分各濃度處理均降低萵苣種子萌發速率，延長了種子的平均萌發周期（表1）。其中，腐解原液0.100 g/mL處理組，中性組分和堿溶性組分0.100 g/mL和0.050 g/mL處理組的萵苣種子萌發速率與對照組差異達極顯著水平，中性組分0.010 g/mL處理與對照組達顯著水平。煙根腐解原液及其組分各濃度處理隨濃度的增加延長了種子平均萌發周期，但延長的幅度并不大，只有在中性組分0.100 g/mL處理和堿溶性組分0.050 g/mL、0.100 g/mL等較高濃度處理組的種子平均萌發周期延長至2.23 d以上，其他各組濃度下對種子平均萌發周期的影響與萌發速率之間呈正相關關系。即，低濃度處理對種子萌發周期影響小，高濃度處理影響大。

2.2 煙草凋萎根腐解液及其組分對萵苣幼苗生長的影響

和對照組相比（表2），煙根腐解原液和堿溶性組分中，除腐解原液0.100 g/mL處理對萵苣幼苗胚軸長度有促進作用（RI=0.17）、堿溶性組分高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）有促進作用（RI=0.14和0.09）外，其余各組各濃度處理均表現為抑制作用。其中，酸溶性組分和中性組分高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）的抑制作用達顯著或極顯著水平。腐解原液各濃度處理隨處理濃度的增加逐漸由抑制作用轉為促進作用（-0.11≤RI≤0.17），各濃度處理間差異不顯著；酸溶性組分和中性組分各濃度處理抑制作用隨著濃度的增加先降低后增加；堿溶性組分各濃度處理隨著濃度的增加逐漸由抑制作用轉為促進作用（-0.28≤RI≤0.14）。

表2 煙根腐解液及其組分對萵苣幼苗生長的影響

和對照組相比，煙根腐解原液除0.050 g/mL處理抑制萵苣幼苗胚根生長外，其余各濃度均表現為促進作用，且以0.010 g/mL處理促進作用最大（RI=0.35），組內規律性不明顯；酸溶性組分和中性組分除0.010g/mL處理表現為輕微的促進作用（RI=0.14和0.01）外，其余各濃度均表現為明顯的抑制作用，其中高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）抑制作用與對照組差異顯著或極顯著，組內的規律性表現為先促進后抑制的趨勢；堿溶性組分各濃度處理均表現為抑制作用，其中高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）抑制作用與對照組差異極顯著或顯著，其作用的規律性不明顯，以0.050 g/mL處理的抑制作用最強（RI=-0.67）。

2.3 煙草凋萎根腐解液及其組分對萵苣幼苗物質積累的影響

雖然堿溶性組分各濃度處理對胚根生長均表現為抑制作用，但由于其高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）對胚軸的促進作用，使得堿溶性組分高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）對萵苣幼苗鮮重有促進作用（表3）。除此之外，其他各組各濃度處理均表現為抑制作用。隨濃度的增加腐解原液對萵苣幼苗鮮重的抑制作用先增強后減弱；酸溶性組分和中性組分的抑制作用則表現為先減弱后增強，其中酸溶性組分高濃度處理（0.100 g/mL和0.050 g/mL）與對照組達極顯著差異水平；堿溶性組分作用規律不明顯。煙根腐解液及其組分各處理對萵苣幼苗干重的影響不顯著，各組內各濃度間差異均不顯著。

2.4 煙草根系腐解液及其組分的綜合化感效應分析

煙草根系腐解液對萵苣種子具有化感抑制作用，且不同組分不同濃度處理條件下，化感作用不同，尤其以酸溶性組分0.100 g/mL處理的化感抑制作用最為強烈（表4）。總體來看，煙草根系腐解液的化感抑制強度為：酸溶性組分＞中性＞堿溶性組分＞腐解原液。

表3 煙根腐解液及其組分對萵苣幼苗物質積累的影響

表4 煙根腐解液及其組分的綜合化感效應強度

3 結論

煙草根系腐解后的腐解物及其不同組分對萵苣種子萌發產生了抑制作用，降低了萵苣種子的萌發速率，延長了種子的萌發周期。試驗表明，煙草根系腐解后對萵苣種子萌發及生長具有化感作用，這與前人在其他作物上的研究相一致[16]，同時證實了煙草根系腐解過程中可形成對植物種子萌發和幼苗生長有明顯抑制作用的化感物質。

化感效應的強弱根據煙根不同組分以及處理濃度的不同而不同，由于試驗過程中處理的條件限制，無法對其進行精細的比較，但從總體的表現來看，煙根腐解物對萵苣種子的化感效應主要規律為：酸溶性組分＞中性＞堿溶性組分＞腐解原液。其中，酸溶性組分對種子萌發和生長的抑制作用隨濃度的增加而增加，這與前人研究相吻合[17]。同時，腐解原液、中性組分和堿溶性組分在不同處理濃度中的表現規律雖存在差異，但均不同程度地抑制了萵苣種子的萌發和生長。以上情況說明，煙根腐解液在較寬的pH范圍內均有抑制種子萌發的化感物質存在，酸溶性化感物質是殘體腐解物產生化感抑制作用的主體。

農業生產中，煙葉采收結束后，殘留的煙根極易腐爛在田間，土壤中的微生物短時間內可以通過腐解作用，將這些煙根所含有的化感物質釋放出來。因此，如不很好地處理這類殘體物質將對煙草生長造成嚴重的影響。在煙草產區，應及時進行煙草各項農藝措施的實施，精細化生產，妥善處理和及時清除煙區煙草殘體物質，防止其在田間地頭腐解，產生化感物質，從而對煙草生長產生自毒作用，進而阻礙連作。

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