長期使用氯米帕明對大鼠睡眠/覺醒及食欲素的影響

李德恒 王興紅 張志國 樊紅坤

睡眠紊亂是大多數抑郁癥患者的癥狀之一。有資料提示，運動覺醒（動物覺醒且處于活動狀態）調節缺陷以及由此可能產生的代償性安靜覺醒（動物覺醒且處于安靜狀態）增加，在抑郁癥的發病中可能起著重要作用[1]。

食欲素（orexin）系統是睡眠、攝食、內分泌、消化、心血管活動調節有關的腦內神經遞質系統。食欲素系統包括食欲素A、食欲素B和食欲素1、2受體 (OX1R，OX2R)。食欲素能神經元通過合成釋放食欲素A增加安靜覺醒，通過釋放食欲素B增加運動覺醒。有研究發現，幼年使用氯米帕明處理的抑郁癥大鼠模型多個腦區的食欲素B明顯降低[2]。這些事實提示，抗抑郁治療很有可能影響食欲素的分泌并相應地產生對覺醒與睡眠的調節。氯米帕明是一種三環類抗抑郁藥，并有很強的抑制快速眼球運動睡眠的作用，治療抑郁癥大多需要長期服藥。我們前期的研究顯示短期使用氯米帕明可以減少運動覺醒而增加安靜覺醒，并且影響食欲素的表達[3]。但是長期使用氯米帕明對睡眠及食欲素表達的影響仍是未知的。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

立體定位儀，日本Narishige公司；多導睡眠記錄儀，美國Grass Instrument公司；低溫高速離心機Avantim J-25型，德國Beckman公司；PCR擴增儀，德國Biometra公司生產；垂直電泳儀，Amersham Pharmacia Biotech公司；PE-480型凝膠圖像分析儀，法國Vilber Lourmat公司。

氯米帕明，美國sigma公司；RNAiso Reagent，aq Enzyme，AMV，寶生物工程(大連)有限公司；引物: 美國Invitrogen公司。

β-actin 編號：NM031144，全長1296 bp，擴增片斷427bp，序列5’-ATG AGG TAG TCT GTC AGG TC- 3’(650-631)；5’-GGT CAG AAG GAC TCC TAC GT-3’(223-242)。

Prepro-orexin 編號：AF041240，全長577bp，擴增片斷479bp，序列5’-TGG CTT TTT GAA CAA CAA CAG ACA TCT -3’ (25-51)；5’-GGA CAG GGC CCG AAG AAC GAC TCA -3’ (504-481)。OX1R 編號：NM001525，全長1564bp，擴增片斷188bp，序列5’-CCT TCC TGG CTG AAG TGA AG -3’ (998-1017)；5’-AGT GGG AGA AGG TGA AGC AG-3’ (1186-1167）。

OX2R 編號：NM001526，全長1843bp，擴增片斷200bp，序列5’-ACA TGG CAC CAC TGT GTC TC-3’（1019-1200）；5’-TGG CTC GGA TCT GCT TTA TT-3’（1219-1200）。

1.2 實驗方法

實驗使用成年SD大鼠，雄性，體重（230±20）g（河南省實驗動物中心提供）。生理鹽水組8只；氯米帕明組8只。給藥方式為腹腔注射CLI 20mg/kg ， 注射生理鹽水0.1ml/20g。每12小時注射1次，共6周。于實驗第5周實施多導睡眠描記電極安裝手術。術后第6天開始睡眠描記。共描記96h睡眠/覺醒資料。描記期間動物自由攝取水和食物，并處于光暗周期(12h:12h)條件下。在描記結束后2h斷頭處死全部大鼠，取額葉皮層、海馬和下丘腦，立即放置于液氮中，用于分子生物學檢測。

1.3 RT-PCR

總RNA提取及RNA 反轉錄均按照試劑所明書進行。PCR按下列組份配置PCR反應液：TakaRa Taq 0.25μL，10×PCR Buffer(Mg2+free)，MgCl2。 dNTP Mixture 4，模板DNA 2.5ng，引物1(1μL)，引物2(2μL)。MgCl2濃度為Prepro-orexin 2.0mmol/L，OX1R 2.2mmol/L，OX2R 2.1mmmol/L。反應條件為Prepro-orexin，94℃3min，預變性，94℃30s ，59℃30s ，72℃40s，24個循環，72℃ 3min。OX1R 94 ℃3min，預變性，94℃30s ，56℃30s ，72℃40s，24個循環，72℃ 3min。OX2R94℃3min，預變性，94℃30s ，56℃30s ，72℃40s， 24個循環，72℃ 3min。β-actin 上述三條件都使用。產物凝膠電泳，凝膠照相，測定cpm值。

1.4 統計分析

使用SPSS16.0軟件進行統計處理，睡眠/覺醒記錄資料和分子生物學數據以均數±標準差（）表示。睡眠/覺醒資料處理使用單因素方差分析，分子生物學資料結果使用t-test檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 氯米帕明對睡眠/覺醒周期的影響

覺醒狀態可以進一步分為運動覺醒和安靜覺醒。結果顯示和對照組相比氯米帕明注射，使得運動覺醒時間減少，安靜覺醒時間增加，差異有統計學意義（P＜0.01），見表1。睡眠狀態也可以進一步分為慢波睡眠和快速眼球運動睡眠。結果顯示氯米帕明使得快速眼球運動睡眠時間減少（P＜0.01），慢波睡眠時間增加（P＜0.05），見表2。

表1 大鼠每日安靜覺醒和運動覺醒的改變(min/D，)

表1 大鼠每日安靜覺醒和運動覺醒的改變(min/D，)

注：與生理鹽水組相比，*P＜0.01

表2 大鼠睡眠和覺醒時間的改變(min/D，)

表2 大鼠睡眠和覺醒時間的改變(min/D，)

注：與生理鹽水組相比，*P＜0.05，** P＜0.01

組別 慢波睡眠時間 快速眼球運動睡眠時間生理鹽水組 696.16±52.14 158.23±13.38氯米帕明組 758.51±12.21* 98.54±8.45**

2.2 氯米帕明對食欲素系統mRNA的影響

腦內食欲素前體mRNA在一定程度上反映了腦內食欲素A、B的水平。結果顯示與對照組相比，注射氯米帕明使得額葉皮層、海馬、下丘腦的食欲素前體mRNA減少，差異具有統計學意義(P＜0.01)，見表3。同時食欲素2受體mRNA減少，差異有統計學意義(P＜0.05，P＜0.01)，見表4。但是上述腦區的食欲素1受體mRNA無顯著變化(P＞0.05)。

表3 食欲素前體mRNA的表達（%，）

表3 食欲素前體mRNA的表達（%，）

注：與生理鹽水組相比， *P＜0.01

組別 額葉皮層cmp 海馬cmp 下丘腦cmp生理鹽水組 65.42±16.38 53.24±12.35 58.06±10.23氯米帕明組 18.05±6.03* 21.34±10.21* 13.25±3.28*

表4 食欲素2受體mRNA的表達（%，）

表4 食欲素2受體mRNA的表達（%，）

注：與生理鹽水組相比，*P＜0.05，**P＜0.01

組別 額葉皮層cmp 海馬cmp 下丘腦cmp生理鹽水組 63.54±31.02 50.23±7.36 72.56±22.31氯米帕明組 15.01±8.02* 14.98±8.23** 12.84±5.28**

3 討論

3.1 氯米帕明對睡眠/覺醒周期的影響

氯米帕明是一種經典的三環類抗抑郁藥。它的藥理作用主要是抑制神經末梢對5-羥色胺和去甲腎上腺素的重攝取，從而延長了單胺類神經遞質的作用時間。本實驗發現，長期使用氯米帕明對快速眼球運動睡眠的抑制與相關文獻的報道的結果是一致的[4]。關于氯米帕明抑制快眼動睡眠的機制尚無直接資料。有研究發現快速眼球運動睡眠的觸發和維持取決于腦干被蓋背外側核和腦腳橋核的膽堿能神經元[5-6]。因此，氯米帕明對快速眼球運動睡眠的抑制機制可能是首先延長了5-羥色胺和去甲腎上腺素的作用后，通過5-羥色胺和去甲腎上腺素受體抑制了膽堿能神經元的活動導致的。同時目前沒有證據證明氯米帕明對膽堿能系統有直接作用。

長期使用氯米帕明抑制運動覺醒，促進安靜覺醒。這一結果與我們前期實驗（短期使用氯米帕明）的結果是一致的[3]。氯米帕明對覺醒的影響是并不改變總覺醒時間。這一現象似乎不能以其對5-羥色胺和去甲腎上腺素重攝取的抑制來解釋。因為這兩種遞質都具有增加覺醒的作用。這些事實表明有可能氯米帕明同時激活了另一覺醒抑制性機制，保護了總的睡眠與覺醒的平衡。而這一機制可能與食欲素神經元有關。

3.2 氯米帕明對食欲素系統三種mRNA 表達的影響

一系列證據表明食欲素和睡眠/覺醒調節有關[2，7]。本實驗發現長期使用氯米帕明顯著抑制了食欲素前體和食欲素2受體mRNA的表達，這種mRNA表達的抑制與氯米帕明所致的運動覺醒減少是一致的。然而，導致這種結果的詳細機制尚無所知。現有資料提示兩種可能：一種可能是，首先氯米帕明抑制了5-羥色胺和去甲腎上腺素的重攝取，延長了這些遞質的作用后；接著5-羥色胺和去甲腎上腺素反饋性地抑制了食欲素能神經元或者食欲素前體的基因表達。但是這一解釋卻不能闡明氯米帕明對食欲素B受體mRNA的表達抑制。另一個可能是，氯米帕明對5-羥色胺和去甲腎上腺素重攝取的抑制作用模擬了運動覺醒的分子生物學變化，而這一變化可能對食欲素B受體mRNA的表達具有負反饋調節作用。支持這一學說的證據有5-羥色胺和食欲素B的釋放均是在肌肉運動時最高，5-羥色胺受體激動劑抑制食欲素能神經元的活動[8]。盡管如此，對這一假說的支持需要更多的直接資料。

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