谷氨酸棒桿菌關鍵酶活性與蘇氨酸高產的關系

張君勝，王 揚，楊曉志，張 力

（江蘇畜牧獸醫職業技術學院動物科技學院，江蘇 泰州 225300）

蘇氨酸（Threonine）是僅次于蛋氨酸、賴氨酸和色氨酸的第4種限制性氨基酸，在醫藥和畜牧業中有非常重要的作用[1]。近年來隨著人們對于蘇氨酸需求量的日益增加，蘇氨酸生產的研究也日益成為了熱點。目前，發酵法以其生產成本低、資源節約、環境污染小等優點逐漸成為工業化生產L-蘇氨酸的主要方式。

在谷氨酸棒桿菌代謝過程中，葡萄糖經糖酵解途徑生成磷酸烯醇式丙酮酸，磷酸烯醇式丙酮酸經二氧化碳固定反應生成四碳二羧酸，經氨基化反應生成天冬氨酸；天冬氨酸在天冬氨酸激酶催化作用下，生成天冬氨酸半醛；天冬氨酸半醛在高絲氨酸脫氫酶的催化下生成高絲氨酸；高絲氨酸在高絲氨酸激酶的催化下生成蘇氨酸[2-3]。在微生物發酵合成L-蘇氨酸的整個代謝途徑中，高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸激酶控制著整個發酵過程中碳源和氮源的走向，它們是決定能否獲得高產L-蘇氨酸的關鍵酶[4]。筆者采用誘變選育的一系列谷氨酸棒狀桿菌菌株，測定其高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸激酶兩個關鍵酶的活性，研究了谷氨酸棒桿菌兩個關鍵酶與發酵產L-蘇氨酸的關系，并對比了誘變處理前后酶活的大小，旨在從更深入的代謝途徑研究L-蘇氨酸產量提高的原因，為L-蘇氨酸的育種工作提供研究依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌 種 谷氨酸棒狀桿菌（Cornebacterium glutamicum）：WS4006、WS4006-1（L-Met-）、D-6（LMet-+L-Lys-）、K-11（L-Met-+L-Lys-+AHVr）、Y-1（L-Met-+L-Lys-+AHVr+Ile-），全部由筆者實驗室誘變獲得[5]。

1.1.2 試 劑 L-天冬氨酸、5-三磷酸腺苷二鈉鹽（ATP）、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷、S-2-氨基乙基半胱氨酸、β-巰基乙醇、三羥甲基氨基甲烷、氯代三苯基四氮唑均為上海生工產品；2，3，5-氯化三苯基四唑（即TTC）為Sigma公司產品；其他試劑均為國產分析純。

1.1.3 培養基 培養基的配制參照文獻[5]。

1.2 方 法

1.2.1 高絲氨酸脫氫酶活性的測定方法 高絲氨酸脫氫酶活性測定參照文獻[6]略有改動，通過測定人造受氫體為2，3，5-氯化三苯基四唑（即TTC）的脫氫酶活性來反映高絲氨酸脫氫酶活性。將谷氨酸棒狀桿菌在肉湯培養基中，30℃，180 r/min培養9 h，使其全部達到對數生長期，此時其酶活性最高。將培養好的新鮮菌液，5 000 r/min離心4min，棄去上清液，加蒸餾水洗滌，搖勻，4 000 r/min離心5 min，棄去上清液（反復3次）。取等體積蒸餾水將菌體配成懸液待用。取若干25mL比色管，分別加入7.5mL Tris-HCl緩沖液、2.5mL 0.4%的TTC溶液、2.5mL 0.36%的Na2CO3溶液和2.5mL純水，并混合均勻。將比色管置于37℃恒溫水浴鍋中振蕩5 min。加入5mL粗酶液以0.5mL甲醛作為空白對照。37℃恒溫水浴鍋培養一段時間后，加入人造受氫體TTC，TTC在細胞呼吸過程中接受氫以后，其還原產物三苯基甲膳（即TF）以紅色結晶存在于細胞內，開始顯色，記下顯色時間。當培養達到一定時間后（一般2 h），加入甲醛作為終止劑，混合均勻，即可終止反應。用5mL 80%丙酮萃取TF，在波長485 nm處測出吸光度值。吸光度的大小就反映了高絲氨酸脫氫酶活性的大小。把1 h產生1μg TF的量作為一個酶活力單位。根據所測得的吸光度值，查標準曲線找TTC-脫氫酶活性，就是高絲氨酸脫氫酶的活性。

1.2.2 天冬氨酸激酶（AKI）活性的測定 天冬氨酸激酶（AKI）的活性測定參照文獻[7]略有改動。將活化后的谷氨酸棒狀桿菌于30℃搖床培養9 h，使其達到對數生長期，然后加入ITPG（終濃度1 mmol/mL）。4 h后收集菌體，6 000 r/min 離心 10min，棄上清液，把菌體懸浮于0.02 mol/L，pH 7.5，含0.03 mol/Lβ-巰基乙醇的冷凍磷酸鉀緩沖液中，超聲破碎后的懸濁液15 000 r/min離心30min，取上清液作為粗酶液。取粗酶液50μL加入到1mL反應液（底物為L-天冬氨酸10 mmol/L，Tris-HCl緩沖液（pH 8.1）94 mmol/L，ATP 10.4 mmol/L，MgSO41.6 mmol/L，β-巰基乙醇 10 mmol/L，NH4OH 800 mmol/L，KCl 800mmol/L）中。反應體系混合均勻后，在30℃恒溫水浴鍋中反應30 min后，加入0.5 mL 12%三氯乙酸中止反應。加入0.5mL 3mml/LHCl和 0.5mL FeCl3·6H2O(溶于 0.1mmo1/LHCl中)。混合物400 r/min離心5 min去沉淀，上清液在600 nm波長處測光密度，以反應液中不加L-天冬氨酸為對照。AKI的測活由在600 nm下反應液的吸光度的大小決定。OD600即為天冬氨酸異羥酸離子的光學密度，酶活則表示為：1 000×OD600值。

2 結果與分析

2.1 TTC標準曲線的制作

取8支20mL的帶有塞子的試管，在試管中依次加入 Tirs-HCl 2 mL，蒸餾水2 mL，TTC系列溶液2mL，對照管中不加TTC，然后再各試管中加入10%Na2S 1mL，充分震蕩顯色后，加入甲醛5 mL，萃取3 min，取上層有機溶液在分光光度計485 nm處比色測定吸光度。所繪制標準曲線如圖1所示。

圖1 TTC脫氫酶活性標準曲線圖

由圖1可以看出TTC脫氫酶活性（TTC-DHA）與吸光度A的關系，得回歸曲線公式：

y表示吸光度A值，x表示TTC脫氫酶活性，R2表示回歸系數。

2.2 基因突變對谷氨酸棒狀桿菌高絲氨酸脫氫酶活性的影響

將谷氨酸棒狀桿菌 WS4006、WS4006-1、D-6、K-11、Y-1分別經過菌液的培養后，用分光光度計測定其吸光度A值，每個測定做3個重復，其吸光度A值如表1所示。

表1 各菌株高絲氨酸脫氫酶的活性

從表1可以看出，選育出的目的菌株隨著遺傳特性的增多，其吸光度A值也逐漸增大。將這些數據代入回歸方程1可以得到各個目的菌株的TTC濃度。原始菌株WS4006脫氫酶的活性很低，0.124 9 U，隨著缺陷型菌株和AHV抗性的選育，其脫氫酶的活性也隨之增高，從WS4006、WS4006-1、D-6、K-11 到 Y-1，高絲氨酸脫氫酶的活 性 由 0.124 9、0.179 3、0.220 0、0.395 6 U 到0.416 0 U，分別是出發菌株的 1.44、1.76、3.17、3.33倍，與此相對應L-蘇氨酸產量由0.31 g/L提高到1.04、1.21、2.43、4.35 g/L，分別是出發菌株的 3.35、3.90、7.84、14.03倍。由此可見，酶活性提高相對應L-蘇氨酸產量也提高。

2.3 基因突變對谷氨酸棒狀桿菌天冬氨酸激酶活性的影響

谷氨酸棒狀桿菌的目的菌株，經過細胞破碎后提取粗酶液，模擬底物和反應體系后，在分光光度計600 nm處測定光密度。具體結果見表2。

表2 各菌株天冬氨酸激酶的活性

原始菌種天冬氨酸激酶的活性只有23.6 U，隨著菌種選育工作的進行，天冬氨酸激酶的活性也逐漸提高，從 WS4006、D-6、K-11 到菌株 Y-1，酶活已經由24 U達到39 U，天冬氨酸激酶的活性分別是出發的原始菌株的 1.17、1.25、1.5、1.65 倍。其中，抗性菌株K-11天冬氨酸激酶活性增幅最大，主要是由于解除了蘇氨酸對天冬氨酸激酶的反饋抑制作用。與L-蘇氨酸合成相對應，可見天冬氨酸激酶活性提高有利于L-蘇氨酸的合成。

3 討 論

本試驗中蛋氨酸缺陷型菌株WS4006-1的選出，解除了蛋氨酸對高絲氨酸脫氫酶的反饋阻遏作用，使高絲氨酸脫氫酶的活性有了一定的提高，但提高不明顯。沈瓊等[7]在研究蘇氨酸操縱子的克隆表達與天冬氨酸激酶的測活時，用分子方法克隆得到thr操縱子，將結構基因裝載于pET-lla質粒上的T7啟動子下游，得到了表達質粒pTHlla-08，經測定天冬氨酸激酶的活性為含載體質粒pET-lla的對照菌的100倍，但L-蘇氨酸產量并沒有大量提高[8]。這與本試驗結論，天冬氨酸激酶活性提高不明顯有很大出入，但L-蘇氨酸產量提高不明顯結果相似。另外李敬坡等[9]研究發現賴氨酸和甲硫氨酸對天冬氨酸激酶活性沒有抑制作用，當蘇氨酸濃度大于0.5mmol/L時，對其活性有明顯抑制作用，并且抑制作用與蘇氨酸呈現濃度依賴性。張雪等[10]經5 L發酵罐發酵產酸實驗，攜帶含蘇氨酸操縱子質粒的W3110菌株L2蘇氨酸產量為2.590 g/L，質粒上thr A解除反饋抑制后，L-蘇氨酸的產量增加到9.223 g/L。此兩人研究結果與本研究相近，由此可見，蘇氨酸反饋抑制不解除的情況下，提高天冬氨酸激酶活性和L-蘇氨酸產量幾乎是不可能的。另外解除蛋氨酸時高絲氨酸脫氫酶的反饋抑制作用沒有完全解除，因為高絲氨酸脫氫酶除了蛋氨酸的反饋阻遏作用外還受到L-蘇氨酸本身的反饋抑制。饒志明等[11]在研究谷氨酸棒狀桿菌高絲氨酸脫氫酶編碼基因hom的敲除來提高L-賴氨酸產量時，發現賴氨酸產量也沒有明顯提高，這也與本試驗結果類似。可能原因是出發菌為原始菌種，沒有經過突變育種改造，影響到了氨基酸產量。

賴氨酸缺陷型D-6（L-Met-+L-Lys-）的選育從一定程度上減弱了L-賴氨酸對于天冬氨酸激酶的反饋抑制作用，使得天冬氨酸激酶活性由原來的23.6 U提高到29.8 U，提高不明顯，可能與L-蘇氨酸自身對于天冬氨酸激酶的反饋抑制有很大關系。蘇氨酸的結構類似物AHV的選育，一方面可以解除蘇氨酸自身對于天冬氨酸激酶的反饋抑制，另一方面也解除了對高絲氨酸脫氫酶的反饋抑制，使得這兩個酶的活性都有了很大提高。從表2也可以看出，這一步高絲氨酸脫氫酶和天冬氨酸激酶的活性提高最為明顯。雖然如此，但L-蘇氨酸產量仍然沒有大幅提高，可能是抗性育種試驗不夠徹底，沒有能夠從根本上解除其自身的反饋抑制作用。

最后選育L-異亮氨酸，是為了不讓積累的L-蘇氨酸進一步流失，原理上對天冬氨酸激酶和高絲氨酸脫氫酶的活性沒有影響，甚至由于分支代謝被切斷，有可能間接抑制他們的活性。Hua等[12]曾報道能夠過量表達天冬氨酸激酶的重組菌在合成培養基中培養，賴氨酸產量提高，但生長受到影響(減弱)；Jetten等[13]的研究結果與其相似。而Koffas等[14]的工作表明重組菌不能在以葡萄糖為碳源的合成培養基上生長。Koffas等認為這可能是由于較高的天冬氨酸激酶活性與回補途徑中回補酶的活性不平衡造成的。

谷氨酸棒桿菌是氨基酸發酵生產的主要菌株，也是氨基酸發酵的模式菌株。本研究對谷氨酸棒桿菌的發酵產L-蘇氨酸和兩個關鍵酶活性的關系進行了研究，由結果可以看出，這兩種關鍵酶的活性還是有了一定的提高。本研究對利用谷氨酸棒桿菌發酵生產L-蘇氨酸菌株的選育具有一定的指導意義。

[1] DebabovV G.The threonine story[J].Adv Biochem Eng Biotechno，2003，79：113-136.

[2]陳殿林.微生物工程技術原理 [M].北京：化學工業出版社，2007.

[3] 張克旭，陳 寧，張 蓓，等.代謝控制發酵[M].北京：中國輕工業出版社，1998.

[4]Thierbach G，Halinoswski J，Bachmann B.Cloning of a DNA fragment from Corynebacterium glutamicum conferring aminoethyl cysteine resistance and feedback resistance to aspartokinase[J].Appl Microbiol Biotechnol，1990，32：443-448.

[5] 王 揚，張 力，李偉星，等.亞硝基胍誘變選育L-蘇氨酸高產菌的研究[J].貴州農業科學，2010，38（4）：107-109.

[6] 趙 智，劉陽劍，王 宇，等.抗反饋抑制的天冬氨酸激酶基因在鈍齒棒桿菌中的表達[J].微生物學報，2005，8（45）：4，530-533.

[7] 沈 瓊，黃雪峰，吳海珍，等.蘇氨酸操縱子的克隆表達及天冬氨酸激酶的測活[J].藥物生物技術，2003，10（3）：133-136.

[8] 天津輕工業學院.氨基酸工藝學[M].北京：中國輕工業出版社，1983.

[9] 李敬坡，韓宏巖，夏 勇，等.極端嗜熱菌Thermus thermophilus HB27中天冬氨酸激酶在大腸桿菌中表達、純化及酶學性質研究[J].山東農業大學學報（自然科學版），2009，40（4）：479-483.

[10]張 雪，閆繼愛，于 雷，等.含蘇氨酸操縱子重組質粒的構建及其對大腸桿菌L-蘇氨酸積累的影響 [J].微生物學報，2009，49（5）：592-597.

[11]饒志明，沈 微，張君勝，等.谷氨酸棒桿菌高絲氨酸脫氫酶編碼基因 hom 的敲除[J].中國生物工程雜志，2007，27（1）：59-63.

[12]Qiang H，Chen Y，Kazuyuki S.Metabolic control analysis for lysine synthesis using Corynebacterium glutamicum and experimental verification[J].Biosci Bioeng，2000，90（2）：184-192.

[13]Jetten M.Follettie M.Sinskey A.Effect of different levels of aspartokinase on the lysine production of Corynebacterium lactofermentum[J].Appl Microbiol Biotechnol，1995，41：76-821.

[14]KoffasM A，Jung GY，StephanopoulosG.Engineeringmetabolism and product formation in Corynebacterium glutamicum by coordinated gene overexpression[J].Metab Eng，2003，5（1）：32-41.