湘西節節草總生物堿的提取及抑菌性研究

陳莉華，張俊生，張 麗，王迎春 ，王 嬌

（1.吉首大學化工學院，湖南 吉首 416000；

2.吉首大學生物資源與環境科學學院，湖南 吉首 416000）

節節草（Equisetum ramosissimumDesf）又稱銼草、筆筒草、節骨草，是木賊科木賊屬植物，生于山坡林下蔭濕處、河岸濕地、甚至雜草地，在湘西各地隨處可見。節節草地上部分干燥后可入藥，在《中華人民共和國藥典（一部）》[1]中學名為木賊（Equisetum hiemaleL.），具有疏風、明目、活血、舒筋之功效，民間常用于治療迎風流淚、翳膜遮睛、跌打損傷、腸風、血痔等疾病[2]。研究表明，節節草中除含有犬問荊堿、犬問荊定堿、小量的菸堿等生物堿外，還含有芹菜素、槲皮素、山奈酚、木栓醇等化合物[3]。

生物堿具有抗菌消炎的作用。如，白屈菜紅堿對植物病原真菌具有抗菌作用[4]；博落回生物堿對多種真菌有抗菌作用[5]；砂生槐子生物堿具有抑制G+金黃色葡萄球菌、G-大腸埃希菌生長繁殖的藥效，以對金黃色葡萄球菌的抑制作用更為顯著[6]；黃連中的小檗堿，可以廣譜抑制病原微生物，如細菌、真菌和原蟲，用于很多疾病的治療[7]。但迄今為止，關于節節草中生物堿提取及抑菌活性的研究，鮮有報道。

考慮到可操作性和可推廣性，本試驗以采集自湘西地區的野生節節草為試驗材料，采用以鹽酸為提取液、以濃氨水沉降、濾集沉淀的方法提取總生物堿，并測定提取物對多種細菌與真菌的抑菌活性，以期為湘西野生藥物資源深加工提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器和材料

儀器：HH-S型水浴鍋（鄭州長城科工貿有限公司），GZX-9070MBE數顯鼓風干燥箱（上海博訊實業有限公司醫療設備廠），SHB-Ⅲ循環式真空泵（鄭州長城科工貿有限公司），ZDP-2120型電熱培養箱（上海智城分析儀器制造有限公司產品）。

材料：野生節節草，采于湘西吉首健身坡，經吉首大學生物資源與環境學院植物教研室鑒定。

試劑：鹽酸、濃氨水、碘化鉍鉀試劑、碘-碘化鉀、硅鎢酸均為分析純。

試驗菌種：藤黃微球菌、黑曲霉菌、青霉菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、奇異變形桿菌、產氣桿菌（以上菌種均由吉首大學生物資源與環境科學學院微生物教研室提供）。

細菌培養基：營養瓊脂固體培養基、霉菌培養基、馬鈴薯培養基。

1.2 試驗方法

1.2.1 節節草總生物堿的提取 新鮮節節草于80℃下鼓風干燥3 h，取出，剪成長2 cm的段狀。準確稱取5 g，用一定量的鹽酸，在一定溫度下的水浴中攪拌提取若干次，每次約1 h。合并多次鹽酸提取液，加濃氨水至pH值9～10，靜置24 h充分沉降，濾集沉淀，在50℃下鼓風干燥，即得節節草總生物堿。

1.2.2 提取條件的單因素試驗和正交試驗設計通過單因素試驗確定最佳試驗值。選取鹽酸濃度、固液比、提取溫度、提取次數等4個因素，每個因素取3個水平,按L9（34）正交表對提取工藝進行研究，確定節節草生物堿鹽酸提取法的最佳工藝參數。

1.2.3 節節草總生物堿的定性檢測 用碘化鉍鉀、碘-碘化鉀、硅鎢酸等3種試劑進行總生物堿的定性鑒定。將制得的節節草粗堿稱取100 g，配制成25mg/mL的溶液。取樣品液各10mL，分置于3個試管，分別加入上述3種試劑，觀察現象。

1.2.4 總生物堿的精制 依武蕓等的方法[8]，將生物堿粗品溶于 200 mL蒸餾水中,用6 mol/L HCl溶液調節其pH值為3～3.5，用乙醚洗滌兩次，10 mL/次，棄去乙醚層，在水層中用體積分數10%的氨水調節pH值為10，再用氯仿萃取2次，方法同上。將所得氯仿液進行蒸餾，即可得總生物堿精制品。

1.2.5 菌懸液的制備 先將試驗所用菌株接種于平板上，37℃培養24 h。然后挑選典型菌落接種于液體培養基中，37℃培養24 h，用無菌生理鹽水將其制成含菌 1×106～1×107cfu/mL 的菌懸液，備用。

1.2.6 抑菌效果測定 （1）紙片擴散法測定抑菌圈。用紙片法進行抑菌效果測定。在無菌操作臺上將滅菌后的固體培養基倒入無菌培養皿中，每皿15～20 mL，待冷卻凝固后，用微量移液器移取200 μL菌液加到平皿上，用涂布棒將菌液涂布均勻，將制得的生物堿配成一定濃度的溶液，將浸透生物堿樣品液的濾紙片揮干，用無菌鑷子夾取，將其貼在含菌平板上，然后用無菌生理鹽水將其濡濕，每皿貼四片。細菌于37℃恒溫培養箱內培養24 h，霉菌于28℃恒溫培養箱內培養24 h，重復3次，測定濾紙片的抑菌圈直徑大小。（2）最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）的測定。采用平板稀釋法，將最優條件下制備的節節草生物堿用無菌蒸餾水進行倍比稀釋，制備 0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36mg/mL 系列濃度稀釋液。然后用無菌吸管將稀釋液分別定量加入到無菌培養皿中,與定量倒入的培養基充分混勻，靜置凝固后,制成含藥液平板。再按培養皿上標的計量，用移液管分別吸取定量被試菌液,涂于平板上，置于適宜溫度下培養一段時間后，觀察菌落生長情況，以平板菌落計數法計算菌落數，另取一系列不加任何藥液的平板作為空白對照。肉眼觀測，以完全沒有菌落生長的最低生物堿濃度作為該藥物的最小抑菌濃度（MIC）。將培養皿置于37℃恒溫箱內培養24 h，重復3次。

2 結果與分析

2.1 節節草總生物堿提取單因素試驗

2.1.1 鹽酸濃度對總堿提取量的影響 稱取節節草5 g，在85℃水浴溫度下，用不同濃度HCl 50mL提取2次，每次提取時間約1 h。

隨著HCl濃度的增大，總生物堿提取量也逐步增大。當 HCl濃度為0.50%、0.75%、1.00%、1.25%、1.50%時，總生物堿提取量分別為0.305 6 g、0.330 7 g、0.331 8 g、0.384 9 g、0.431 2 g。其中，以鹽酸濃度為1.5%時的總生物堿提取量最大。因此，選用此鹽酸濃度進行后續的試驗。

2.1.2 固液比對總堿提取量的影響 在其他條件相同的情況下，改變固液比進行提取，結果如下：當固液比為 1∶10、1∶14、1∶18、1∶22、1∶26 時，總生物堿提取量分別為 0.340 1 g、0.398 8 g、0.422 7 g、0.406 5 g、0.308 0 g。

由以上結果可知，隨著固液比的增加，總生物堿提取量也逐步增大，到1∶18時達到極值。此后，總生物堿提取量隨著固液比的上升而下降，當固液比為1∶26時，總生物堿提取量劇烈下降。因此，選定固液比為1∶18進行后續試驗。

2.1.3 提取溫度對總堿提取量的影響 當提取溫度為70℃、75℃、80℃、85℃、90℃時，總生物堿提取量分別為 0.231 0 g、0.282 3 g、0.252 4 g、0.312 8 g、0.286 7 g。其中，當提取溫度為85℃時，得到的總堿量最大，故后續試驗中選取溫度為85℃。

2.1.4 提取次數對總堿提取量的影響 稱取一定量的節節草樣品，在85℃水浴溫度下，按照上述條件提取若干次，每次提取時間約1 h。當提取1次、2次、3次、4次、5次時，總生物堿提取量分別為0.135 2 g、0.324 5 g、0.416 5 g、0.518 2 g、0.519 4 g。

由以上結果可知，隨著提取次數的增多，提取物中總堿含量增大，但提取次數過多，會使得生產周期過長，綜合考慮后，選用提取次數為2次。

2.2 節節草總生物堿提取工藝的正交試驗

以總堿量為指標,考察提取工藝中鹽酸濃度、固液比、提取溫度、提取次數等4個因素對提取量的影響，設計了如下的因素水平表并進行正交試驗，結果見見表1及表2。

表1 正交試驗因素表

試驗結果表明，各因素對提取效果的影響程度依次為：提取次數>固液比>提取溫度>鹽酸濃度。這表明，在以鹽酸為提取液的節節草生物堿提取方法中，提取次數對節節草生物堿有顯著影響，固液比次之，而鹽酸濃度的影響不大，優選工藝為A3B3C2D3，即 1.25%的鹽酸，固液比 1∶18，在 90℃水浴提取3次，每次提取1 h。

2.3 節節草總生物堿的定性鑒定

用碘化鉍鉀、碘-碘化鉀、硅鎢酸等3種試劑聯合進行總生物堿的定性鑒定，3種試劑均須有明顯反應才能證明有生物堿存在。參照1.2.3的方法，各試劑表現的現象分別為有棕紅色沉淀、無定形沉淀、有結晶形沉淀。監定結果證實，有生物堿成分存在。

表2 正交試驗結果及分析

2.4 節節草總生物堿抑菌試驗

2.4.1 節節草總生物堿抑菌圈直徑的測定 按1.2.6的試驗方法，用節節草總生物堿樣品液進行抑菌試驗，抑菌圈直徑越大表明抑菌效果越好，結果見表3。

表3 節節草生物堿的抑菌活性

試驗結果表明，節節草總生物堿對奇異變形桿菌、大腸桿菌（革蘭氏陰性菌）、藤黃微球菌有強的抑菌活性；對黑曲霉菌、枯草桿菌、產氣桿菌都有較強的抑菌活性；但對青霉菌、金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性菌）沒有表現出抑菌活性。

2.4.2 節節草總生物堿最小抑菌濃度的測定 按1.2.6的試驗方法，用節節草總生物堿樣品液進行體外最小抑菌濃度試驗，抑菌圈直徑越大表明抑菌效果越好，結果見表4。

表4 節節草總生物堿MIC的測定結果 （cfu/mL）

由表4可知，節節草總生物堿對大腸桿菌、藤黃微球菌的最小抑菌濃度為0.16mg/mL，對奇異變形桿菌、枯草桿菌、黑曲霉菌的最小抑菌濃度為0.20 mg/mL，對產氣桿菌的最小抑菌濃度為0.24 mg/mL。這表明，節節草總生物堿對這6個菌種均具有較好的抑菌效果。由此看出，節節草總生物堿對致病菌有強的抑菌效果，與民間用于治病的習俗互為佐證。

3 結 論

通過對節節草中總生物堿提取方法的單因素試驗，確定了鹽酸濃度、提取次數、提取溫度、固液比等4個因素在正交試驗中的水平。由L9（34）正交試驗得出最佳提取工藝條件為：1.25%的鹽酸，固液比為1∶10，90℃水浴提取3次，每次提取1 h。通過對節節草總生物堿抑菌性的研究，可知節節草總生物堿對大部分菌種具有較強的抑菌活性，而對青霉菌、金黃葡萄球菌沒有表現出抑菌活性。

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