ε-聚賴氨酸在南美白對蝦保鮮上的應(yīng)用

侯偉峰，謝 晶，林永艷

（上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306）

南美白對蝦（Penaeus Vanmamei）屬易腐食品，在捕撈、運(yùn)輸、加工及貯藏過程中極易受細(xì)菌侵襲而腐敗變質(zhì)。特別是其死亡后，在酶類的作用下進(jìn)行無氧降解，隨著糖原和ATP的減少，蝦體開始變硬，并很快進(jìn)入僵硬期，當(dāng)體內(nèi)的ATP分解完后，蝦肉會進(jìn)一步降解，直至腐敗變質(zhì)。另外，蝦體內(nèi)存在大量的多酚氧化酶，能夠使蝦體表面產(chǎn)生雙酚類物質(zhì)，再轉(zhuǎn)變成有色的醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)具有較高的活性，極易與氨基酸或蛋白質(zhì)結(jié)合成黑色素，從而導(dǎo)致蝦的黑變[1]。傳統(tǒng)的保鮮方法如低溫保藏、化學(xué)防腐劑保藏因其方法在防黑變和安全上的局限性已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足人們對南美白對蝦貨架期的要求。

ε-聚賴氨酸（以下簡稱ε-PL）是目前天然防腐劑中具有優(yōu)良防腐性能的微生物類食品防腐劑。ε-PL最早是由日本的Shima和Sakait在白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）的發(fā)酵液中被分離得到的，它是由25～30個賴氨酸殘基聚合而成的[2]，有較強(qiáng)的抑菌能力，具有安全性高、抑菌譜廣、pH范圍大、熱穩(wěn)定性好等特點(diǎn)[3]，ε-PL在人體內(nèi)分解后能夠產(chǎn)生人體所必需的氨基酸——賴氨酸，因此安全性較高，已于2003年10月被FDA批準(zhǔn)為安全食品保鮮劑。目前，ε-PL的在日本已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但該保鮮劑的應(yīng)用在國內(nèi)還處在實(shí)驗(yàn)室階段，ε-PL生物防腐劑開發(fā)和生產(chǎn)還處于起步階段，而在南美白對蝦保鮮上的應(yīng)用更是空白，因此具有較大的研究意義。為了延長南美白對蝦貨架期，優(yōu)化保鮮劑的選擇，筆者研究了不同濃度的ε-PL在南美白對蝦保鮮中的應(yīng)用，以期為ε-PL在食品保鮮中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要設(shè)備及試劑

試驗(yàn)材料：鮮活南美白對蝦（購自上海市南匯新蘆苑農(nóng)貿(mào)市場），聚乙烯（PE）加厚保鮮袋（上海豪亞塑料制品有限公司）。

主要設(shè)備：Kjeltec2300凱氏定氮儀（瑞士FOSS公司）；Sartorins PB-10精密數(shù)顯酸度計（賽多麗斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）；UV-3000 PC型紫外可見分光光度計（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；YXQLS-30SH全自動立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；潔凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

主要試劑：ε-PL（食品級，浙江銀象生物工程有限公司）；平板計數(shù)瓊脂（北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司）；硼酸、輕質(zhì)氧化鎂、甲基紅、溴甲酚綠、無水乙醇、甲苯、碳酸鈉等，均購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，試劑均為AR級。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理 采集大小均一健康的南美白對蝦，保活運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，剔除死亡、肢體殘缺、變色等異常個體，用自來水沖洗，放入碎冰水中猝死。隨機(jī)分 5 組，編號分別為 CK、A1、A2、A3、A4，其中 CK 為對照組，其他為添加ε-PL組，ε-PL用無菌蒸餾水進(jìn)行溶解配比。分組后的南美白對蝦在不同濃度ε-PL溶液中浸泡3min，取出室溫下1 min內(nèi)瀝干（必要時用超凈風(fēng)吹干），立刻裝入無菌保鮮袋，標(biāo)記于4±1℃冰箱內(nèi)儲藏9 d。對照CK組用無菌蒸餾水代替ε-PL溶液。

1.2.2 分組方法 ε-PL對細(xì)菌的最低抑菌濃度（MIC）中的最大量是150μg/mL[2]，在應(yīng)用中常以2倍MIC進(jìn)行添加，因此一般選擇的添加量為0.03%左右。通過蝦體吸水性試驗(yàn)，結(jié)果表明，蝦體對保鮮劑溶液的吸收率為5.2%，因此，在實(shí)際研究中，ε-PL 濃度設(shè)置以下分組：CK，0；A1，0.05%；A2，0.10%；A3，0.25%；A4，0.50%。

1.3 品質(zhì)指標(biāo)及測定方法

處理好的蝦經(jīng)分組后，在4±1℃冰箱內(nèi)儲藏9 d，前4 d隔天測定感官指標(biāo)、pH值、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）、細(xì)菌總數(shù)（TBC）以及三甲胺（TMA）等品質(zhì)指標(biāo)，后5 d每天各測一次，并分析不同處理組的差異。

1.3.1 感官品質(zhì)評定 依據(jù)對蝦的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[4]，對蝦的感官品質(zhì)指標(biāo)要求蝦體完整，體表有光澤；頭胸甲與體節(jié)間連接緊密，眼球飽滿突出，肌肉紋理清晰，有彈性，殼不易剝離，具有對蝦固有氣味，無任何異味。由6名感官評定人員組成感官品質(zhì)評定小組，對南美白對蝦從肌肉組織、體表色澤和氣味3方面進(jìn)行綜合評分，取其平均值，總分值在9分（極新鮮）和0分（完全腐敗）之間，6分以下表明樣品已不可食用。隔天評定一次，并對各組評定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.2 pH值測定 取5 g經(jīng)組織搗碎機(jī)搗碎的蝦體肌肉于錐形瓶中，加入45mL無菌中性蒸餾水，靜置30min，過濾，用精密酸度計測定濾液的pH值[7]。

表1 南美白對蝦感官評分標(biāo)準(zhǔn)[5-6]

1.3.3 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測定 使用自動凱氏定氮儀，依據(jù)半微量凱氏定氮原理進(jìn)行測定[8]。具體方法為準(zhǔn)確稱取5 g搗碎樣品至FOSS消化管中，加入0.5 g的輕質(zhì)氧化鎂，上機(jī)測定。重復(fù)3次，取平均值。

1.3.4 菌落總數(shù)的測定 按照GB/T 4789.2-2008規(guī)定的傾注平板計數(shù)法進(jìn)行[9]，每個梯度做三個平行。

1.3.5 三甲胺（TMA）的測定 利用分光光度計法測定南美白對蝦中的三甲胺含量[10-11]。稱取試樣5 g（可根據(jù)三甲胺含量適當(dāng)增減，精確至0.000 1 g）置于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水至刻度，振蕩15 min，過濾至100 mL容量瓶中。取此液5.00 mL置于25mL有蓋試管中，另取5mL水做空白試驗(yàn)，分別加入1 mL碳酸鎂甲醛溶液、10.00 mL甲苯、3 mL飽和碳酸鉀溶液，用力振搖1 min后靜置5 min。將甲苯層移入內(nèi)有0.5 g無水硫酸鈉的20mL有蓋試管中，脫水（甲苯層盡量多取，8～9 mL）。取此液5.00mL，在15mL試管中分別加5.00mL苦味酸甲苯溶液，混勻，在波長410 nm處比色，以試劑空白為參比液，測其吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品三甲胺含量按如下公式計算：y=60.373 A，其中y為三甲胺含量，單位為μg/g，A為吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel繪圖，利用SPSS17.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±平均偏差表示，利用t-檢驗(yàn)進(jìn)行組間分析，當(dāng)p<0.01時為極顯著差異，0.010.05時差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 南美白對蝦感官品質(zhì)評定結(jié)果

南美白對蝦感官評定結(jié)果如表2所示。由表可知，隨著儲藏時間的延長，各處理組感官評分均呈下降趨勢，其中對照組CK下降速度最快，在第4天便達(dá)到5.53分，即低于6分，盡管樣品在氣味、組織方面仍為良好，但外觀已達(dá)到不可接受的界限，樣品已不可食用，這與凌萍華[12]的研究結(jié)果一致；而添加保鮮劑組（A1、A2、A3、A4）總分均明顯高于對照組（p<0.05），并且到第6天其感官總分才低于6分；在各處理組之間，除了在第4天A1和A2、A4之間及第5天A2和A3具有顯著差異外（p<0.05），其余均無顯著差異。這表明，少量的ε-PL對南美白對蝦有較好的保鮮效果，并且濃度之間的差異性不大。

表2 南美白對蝦感官品質(zhì)評定結(jié)果

2.2 南美白對蝦pH值的變化

南美白對蝦在儲藏的過程中，隨著時間的延長，其pH值會有一系列變化，Goncalves[13]通過在空氣包裝、冰蓄冷保藏、氣調(diào)包裝條件下處理北極甜蝦，認(rèn)為在3種條件下，pH值不可接受值分別為7.56、7.64和7.55。Shamshad[14]認(rèn)為墨吉對蝦的pH不可接受值為7.60。而動物性組織在儲藏的過程中，在死亡初期，由于血液循環(huán)和體內(nèi)供應(yīng)氧的停止，會發(fā)生糖酵解作用生成琥珀酸、乳酸等有機(jī)酸，從而導(dǎo)致肌體pH值下降，隨著時間的延長，細(xì)菌滋生，蛋白質(zhì)發(fā)生分解產(chǎn)生堿性物質(zhì)，pH值會逐漸上升[15]。

由圖1可知，南美白對蝦新鮮樣pH值為6.87，在第2天出現(xiàn)pH最低點(diǎn)，隨后的儲藏過程中，各組pH均呈上升趨勢，這與王四維[16-18]等對南美白對蝦的研究相似。由圖可知，對照組pH值明顯高于添加保鮮劑組（p<0.05），由此可見，ε-PL保鮮劑對蝦體pH上升有明顯的抑制作用。

圖1 不同聚賴氨酸濃度下蝦的pH值的變化

2.3 南美白對蝦揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的變化

南美白對蝦經(jīng)不同濃度的ε-PL溶液處理后，其TVB-N的變化情況如圖2所示。TVB-N是指動物性食品在腐敗過程中，由于霉和細(xì)菌的作用，組織中的蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生的氨以及低級胺類等堿性含氮物質(zhì)。通常可用TVB-N作為水產(chǎn)品的腐敗評價指標(biāo)，一般TVB-N隨著鮮度的下降而增加，對于蝦類，按照DB33/451—2003海捕蝦質(zhì)量要求規(guī)定[19]：海蝦一級、二級、三級鮮度的TVB-N值上限分 別 為 15 mg/100g、20 mg/100g、30 mg/100g。 當(dāng)TVB-N值超過規(guī)定的三級鮮度時，一般認(rèn)為不可食用。

圖2 不同聚賴氨酸濃度下蝦的揮發(fā)性鹽基氮的變化

由圖2可知，各組TVB-N值隨著儲藏時間的延長呈上升趨勢，對照組CK在整個過程中上升速度較快，并且在第2天TVB-N值已經(jīng)超過一級鮮度上限，為18.755 2 mg/100g，而用ε-PL處理后的南美白對蝦，在第4天才達(dá)到一級鮮度上限，而此時對照組已接近二級鮮度上限。對照組和試驗(yàn)組從第4天開始，TVB-N的差異極顯著（p<0.01），但經(jīng)ε-PL溶液處理的各組，TVB-N的差異不顯著（p>0.05）。在整個試驗(yàn)過程中，經(jīng)ε-PL處理的組別均未達(dá)到規(guī)定的三級鮮度上限，但根據(jù)感官評定結(jié)果，從第6天開始，蝦的感官已經(jīng)不可接受，因此被認(rèn)為不可食用。

2.4 南美白對蝦菌落總數(shù)（TBC）的變化

南美白對蝦菌落總數(shù)的變化情況如圖3所示。由圖可知，對照組的菌落總數(shù)呈直線上升，并且上升速度較快，其他試驗(yàn)組也呈上升趨勢，在儲藏的第2天，各組差異不明顯（p>0.05），但此后試驗(yàn)組菌落總數(shù)均顯著低于對照組（p<0.01）。根據(jù)Mosfer M[20]研究，蝦類的菌落數(shù)≤5.0 lg（cfu/g）為一級鮮度；5.0～5.7 lg（cfu/g）為二級鮮度，當(dāng)細(xì)菌總數(shù)超過二級鮮度時，通常認(rèn)為蝦已腐敗不可食用，此時判定為貨架期的終點(diǎn)。

由圖3可知，對照CK組在第4天菌落總數(shù)已達(dá)到5.6 lg（cfu/g），即將超過二級鮮度，與對照組相比，其他各試驗(yàn)組菌落總數(shù)最高的為A4組，僅為4.4 lg（cfu/g），仍在一級鮮度以下；從第5天開始，對照組菌落總數(shù)已超過二級鮮度，而其他試驗(yàn)組在第7天才超過一級鮮度指標(biāo)。這與南美白對蝦TVB-N的變化情況一致。可見，ε-PL可抑制南美白對蝦菌落的生長，具有良好的防腐保鮮作用。

圖3 不同聚賴氨酸濃度下蝦的菌落總數(shù)的變化

2.5 南美白對蝦三甲胺（TMA）的變化

三甲胺[（CH3）3N]是由氧化三甲胺[（CH3）3NO]在細(xì)菌的作用下還原生成的，氧化三甲胺廣泛分布在豬肉、魚肉和蝦中，它具有特殊的鮮味。同時，生物體內(nèi)的卵磷脂經(jīng)微生物作用也分解產(chǎn)生三甲胺[21]。生成的三甲胺越多說明豬肉和魚蝦的鮮度越差。圖4為不同濃度的ε-PL處理下，南美白對蝦的三甲胺隨時間的變化情況。由圖可知，樣品三甲胺的初始值為0.510 1μg/g。在儲藏的前4天，各組三甲胺含量均呈明顯的上升趨勢，這可能是由于在蝦體腐敗變質(zhì)的初期，三甲胺含量增加。三甲胺為最簡單的叔胺，其沸點(diǎn)僅為24℃，在常溫下為無色氣體，易于揮發(fā)，在其后的6天里，三甲胺的含量有一定的波動，可能主要是較高的室溫造成一定的揮發(fā)所引起的，具體的原因還有待進(jìn)一步的研究。但總體而言，除了A3組外，對照組明顯高于其他各試驗(yàn)組（p<0.05），特別是A1組在第5、7和9天，A2組在第8天，三甲胺含量低于其他組，由此可知，ε-PL對南美白對蝦的保鮮作用并不是濃度越大效果越好，在最適的濃度條件下才能取得最好的保鮮效果。

圖4 不同聚賴氨酸濃度下蝦的三甲胺的變化

3 結(jié) 論

不同濃度的ε-PL溶液對南美白對蝦保鮮效果的研究結(jié)果表明：與對照組相比，ε-PL能明顯延長南美白對蝦貨架期2～3 d；通過感官評定、TVB-N、pH、菌落總數(shù)和三甲胺指標(biāo)的測定，ε-PL處理后的試驗(yàn)組均與對照組有顯著的差異（p<0.05），但試驗(yàn)組間差別并不明顯。各濃度的比較分析認(rèn)為用0.1%的ε-PL溶液處理南美白對蝦，能夠取得較好的效果。但黑變分析表明，盡管ε-PL能夠明顯降低蝦的菌落總數(shù)和TVB-N，但在防黑變的效果方面并不理想，因此單一保鮮劑的利用具有一定的弊端，在今后的研究中期望通過不同保鮮劑的復(fù)合利用，以進(jìn)一步完善南美白對蝦的保鮮效果，延長其貨架期。

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