乙醛脫氫酶及其醫療領域研究進展

毛跟年,李 鑫,瞿建波

陜西科技大學生命科學與工程學院,西安 710021

乙醛脫氫酶及其醫療領域研究進展

毛跟年＊,李 鑫,瞿建波

陜西科技大學生命科學與工程學院,西安 710021

對乙醛脫氫酶的種類、基本特性、制備、檢測及其在醫療領域中應用作了簡要的概述,旨在為該酶的進一步研究提供參考。

乙醛脫氫酶;性質;臨床應用

Abstract:This article reviews the types,basic characteristics,preparation,testing,and application in the medical field of aldehyde dehydrogenase.In order to provide some references for its advanced research.

Key words:aldehyde dehydrogenase;characteristics;clinical

乙醛脫氫酶 (aldehyde dehydrogenase,ALDH)廣泛存在于真核生物和原核生物中,在輔酶 I存在的條件下,它催化包括乙醇在內的某些一級或二級醇、醛和酮的脫氫反應[1]。在人類和其他許多動物體內,線粒體乙醛脫氫酶能把對生物體有害的醇類轉化,所以在細胞解毒研究中乙醛脫氫酶受到高度關注[2];同時,乙醛脫氫酶在分子生物學以及相關疾病的檢測方面也多有應用。因此,乙醛脫氫酶的研究具有重要的理論意義和應用價值。文中從乙醛脫氫酶的種類、性質、結構、制備、酶活測定及其在醫療領域的應用幾個方面綜述了乙醛脫氫酶的研究進展。

1 乙醛脫氫酶的種類

乙醛脫氫酶家族 (ALDHs)是一系列氧化各式各樣脂肪族醛、芳香族醛為相應酸的酶[3]。哺乳動物乙醛脫氫酶根據其亞細胞所在位置、結構與動力學特性和原始序列的相似性可以分為三類[4]。第一類是細胞質的 (ALDH1),第二類是線粒體的 (ALDH2),第三類則是可誘導性的細胞質的乙醛脫氫酶和可誘導性的微粒體的乙醛脫氫酶 (如 ALDH3)。目前,對前兩類乙醛脫氫酶進行了廣泛的研究,并發現其有效促使短鏈脂肪族醛和芳香族醛的氧化。相比較之下對第三類乙醛脫氫酶的研究較少特別是對微粒體乙醛脫氫酶的研究,大鼠肝臟、兔子腸道、人類肝臟和人白血細胞中都發現了微粒體乙醛脫氫酶的存在[1],但作用機制尚不明確。

2 人類乙醛脫氫酶性質和結構

人體乙醛脫氫酶為多肽四聚體,根據四元結構和其他生化特征,至少有 7種不同基因編碼 ALDH(ALDH1、ALDH2……ALDH7),但根據底物特異性和亞單位組成,只有 ALDH1和 ALDH2才被認為是“真”ALDHs,為人體肝內的兩種主要同工酶,他們的基因分別位于 9號和 12號染色體。ALDH2位于線粒體內,而 ALDH1、ALDH3、ALDH4位于胞液內。ALDH1和 ALDH2為純四聚體,由分子量為 54000的亞單位組成,含 500-501個氨基酸,他們的氨基序列中 68%是相同的[5],并且具有相類似的三維立體結構[6-8]。人類紅細胞含有一種 ALDH,和肝細胞液內的 ALDH1相同。ALDH2表現出遺傳多態性,ALDH2缺乏者有一個或兩個等位基因突變,形成純合子或雜合子,為常染色體顯性遺傳。突變的非典型ALDH2基因形成功能喪失的酶即非典型雜四聚體酶 (aaab、aabb、abbb、b表示非典型亞單位 )和非典型純四聚體 (bbbb),不能有效代謝乙醛。

3 乙醛脫氫酶的制備

目前,天然的 ALDH難以獲得,大多是從動物的肝臟、胰腺或肝細胞線粒體中提取,其資源有限且價格昂貴,因此很難大規模生產,為了拓展 ALDH的來源,科學家們探索從微生物中提取 ALDH。國外在此方面做了大量工作,早在上個世紀 70年代,Keith A.Bostian[9]就對從釀酒酵母中提取 ALDH進行了研究。國內吳桂英等[10]報道了從破碎酵母細胞提取 ALDH的新工藝,考察了自溶、反復凍融、超聲波和高壓破碎儀的細胞破碎方法對釋放 ALDH的影響;周百靈等[11]利用超聲波破碎、硫酸銨分級鹽析以及 DEAE-32陰離子交換層析等方法提取了釀酒酵母胞漿內的 ALDH并對其酶學性質進行了研究,這就為酶的獲得提供了寶貴資料。

在探討從微生物中提取乙醛脫氫酶的同時,學者們還通過對菌種定向誘變和培養基優化提高微生物的酶產量。劉清利[12]等通過紫外線和 He-Ne激光誘變醋酸菌,選育出 1株乙醛脫氫酶高產菌株Z07-J01,該正突變 24 h發酵酶活為 1008.00 U/g濕菌體,比出發株提高了 276%,且酶活在 10代內穩定;王紅波[13]等通過單因素試驗和正交試驗,對巴氏醋桿菌產乙醛脫氫酶的發酵培養基進行了優化,確定了培養基的最適條件和組分,提高了發酵培養生物量和產酶酶活;吳桂英[14]等人還對對酶學性質及發酵條件也進行了初步的研究,得到釀酒酵母產乙醛脫氫酶的最優發酵條件。

4 乙醛脫氫酶的測定

乙醛脫氫酶的測定可以采用多種不同的體系,常用的ALDH酶活測定采用脫氫酶酶活測定的方法。酶、輔酶 NAD+和底物在一定溫度和 pH的條件下反應,通過每分鐘波長 340 nm處吸光度值的變化,可以算出每分鐘 NAD+轉化為 NADH的量,從而得到該酶酶活[15]。一般定義每分鐘波長 340 nm處吸光度值變化 0.001為一個活力單位 (U)。常用的檢測體系有 O K IB E[16]的 3 mL反應體系;Keirh A.Bostian的 2.5ml檢測體系等。

5 乙醛脫氫酶在醫療領域的應用研究

5.1 乙醛脫氫酶與酒精中毒

各種酒類都含有乙醇,可引起飲酒后臉紅、心跳加速、皮膚加熱、血壓升高的急性酒精中毒癥狀,但這主要不是由于血液中乙醇濃度的升高,而是由于血液中乙醛濃度的升高造成的;研究表明[17],乙醛具有強烈的毒理作用,可刺激腎上腺素、去甲腎上腺素等物質的分泌,引起面紅耳赤、心率快、皮溫高等癥狀。而人類對酒精耐受性有種族的和個體的差異,黃種人中 80%為酒精敏感者,白種人中僅 5%為酒精敏感者。大多數黃種人在飲酒后產生乙醛速度快,而氧化為乙酸的速度慢,故易產生乙醛蓄積中毒[18]。也就是說,乙醛脫氫酶的不足使乙醛在體內積累導致中毒現象,乙醛對引起急性酒精中毒癥狀比乙醇起更重要的作用。解酒重在加速乙醛的分解,使之產生乙酸,進一步分解為 CO2和 H2O,而在此過程中乙醛脫氫酶的作用尤為重要。

5.2 乙醛脫氫酶與肝損傷

乙醛可以作為高活性物質,與乙醇性肝損傷的發展密切相關。肝細胞線粒體內的乙醛可被 ALDH氧化為乙酸,當 ALDH活性降低時,未被氧化的乙醛進入血內,通過黃嘌呤氧化酶轉變為超氧化物,進而導致膜脂質過氧化,丙二醛和壬烯是 2個強毒力的脂質過氧化終產物,常作為判斷脂質過氧化的指標。他們可進一步促進枯否細胞和肝細胞釋放細胞因子,破壞細胞膜,最終促進肝損傷[19]。同時,Surrenti[20]等還觀察到 ALDH活性的減弱與肝損傷的程度是平行發展的。

5.3 乙醛脫氫酶與心血管疾病

乙醛脫氫酶 2(ALDH2)是線粒體內一種重要的醛類氧化酶,在心血管疾病的發生、發展過程中發揮重要作用。ALDH2野生型能夠抑制心肌細胞凋亡發揮心肌保護作用[21],是心力衰竭和心肌病的保護因子。ALDH2還是體內重要的氧化應激分子,ALDH2野生型能夠減少體內的氧化應激,減緩動脈粥樣硬化進展[22];增加斑塊的穩定性,減少心肌梗死。提高ALDH2活性有望成為心血管疾病治療的突破點。

5.4 乙醛脫氫酶與神經系統

人類神經 tau蛋白具有穩定細胞微管系統、調控神經細胞生長發育的功能[23],并在神經系統的形成和軸突的通訊傳導中起著至關重要的作用[24]。tau是一種磷酸化蛋白,其功能主要通過磷酸化調節。超磷酸化可導致 tau蛋白分子的聚集,形成配對螺旋樣纖維[25],這是老年性癡呆在病理學上的基本病變之一。乙醛可能使 tau分子錯折疊而產生超磷酸化,華茜,聶春來等[26]用乙醛對人類神經 tau進行醛胺化,通過 NCLK(neuronal cdc2-like protein kinase)和 [γ-32P]ATP對其磷酸化,磷酸化的產物經胃蛋白酶降解及 HPLC(C-18)分析降解片段,發現醛胺化 tau的降解物中有兩個新的磷酸化肽段(A4和 A6)。可見及時降解體內的乙醛顯得尤為重要,而開發乙醛脫氫酶類蛋白質藥物,不失為一種好的選擇。

5.5 乙醛脫氫酶與腫瘤

長期的大量攝入乙醇會增加上消化道癌 (口腔、咽、喉和食道)、胃癌以及直腸癌的發病率。研究表明乙醛有直接的誘變和致癌性。乙醛可使得DNA發生點突變,從而誘導姐妹染色單體交換和染色體異常[27]。乙醛導致 DNA復制異常和削弱修復作用的一個機制就是形成穩定的 DNA絡合物[28]。有很多流行病學研究已經證實,攜帶 ALDH2＊2等位基因的亞洲人因酗酒引發消化道癌癥的幾率明顯較大:胃癌、結腸癌、肺癌為 3～10倍;咽癌、食道癌為 11～15倍[29];而食道癌、咽癌和肺癌同時發病的幾率增加了 50倍。

5.6 乙醛脫氫酶在生理代謝方面的研究

乙醛可以共價地與微粒體蛋白結合形成乙醛蛋白絡合物。后者可以作為新抗原刺激機體引起相應的免疫應答,導致肝細胞損傷。乙醛可以與酶的重要功能基團結合,導致酶活性改變,影響酶的功能。乙醛還可以與細胞內微管中的管蛋白結合。微管的重要功能之一就是促進蛋白質的細胞內轉運和分泌,肝內蛋白質分泌障礙,導致蛋白質在肝內滯留,引起肝細胞損傷。早期乙醇性肝纖維化和肝硬化形成過程中,肝星形細胞活化,導致肝星形細胞中的 I型膠原和纖維連接蛋白基因增加,從而引起細胞外基質在肝內沉積,肝纖維化形成[19,20]。

同時,乙醛可與體內一些蛋白質、磷脂、核酸等呈共價鍵結合,形成穩定的加合物。ALDH的生理意義在于它對乙醛的解毒作用。乙醛在肝臟和其他器官內的氧化由 NAD+-依賴性 ALDH催化,酶促反應是不可逆的,它以直鏈和支鏈的脂肪族和芳香族醛作為底物,產生對應的酮酸[30]。

5.7 乙醛脫氫酶在臨床研究上應用

2007年 Ginestier[31]等發現 ALDH1是乳腺癌干細胞的標記物,此后,在白血病,視網膜母細胞瘤等多種腫瘤干細胞中均發現有ALDH1表達[32,33],ALDH1能氧化環磷酰胺的中間代謝產物醛磷酰胺,形成無毒的羧基磷酰胺,從而發揮對 CTX的解毒作用[34],而且細胞中 ALDH1水平可以用來預測環磷酰胺治療的療效,由于ALDH1的解毒作用導致腫瘤對環磷酰胺的耐藥。另有研究表明,經化療后的結直腸癌組織中腫瘤干細胞有 ALDH1的表達[35]。

國內研究中,周凌,虞佩等[36]采用免疫組織化學染色法檢測 92例乳腺癌患者腫瘤組織中 ALDH1蛋白的表達,并結合臨床病理特性進行相關性分析和無病生存期分析,結果表明ALDH1蛋白表達陽性的乳腺癌患者其無病生存率與耐藥有關,ALDH1可作為乳腺癌預后判斷的指標,可用于鑒別乳腺癌組織中的“類干細胞”群落;潘兆軍,江志敏等[37]研究發現ALDH1在結腸癌組織中有一定高表達率,其高表達提示預后不良,可作為評價結腸癌預后指標,促進腫瘤干細胞的臨床實踐。

另有研究發現,乙醛脫氫酶在活的造血干 /祖細胞 (HSPC)中高表達,乙醛脫氫酶活性檢測可以作為檢測臍帶血中 HSPC的一個有用指標[38],拓寬了其應用領域。

6 結語

近年來,隨著生物技術日新月異的發展,對乙醛脫氫酶的研究越來越深入,研究了該酶的基因多態性、分子結構、理化性質,報道了該酶的誘導劑、激活劑、抑制劑,并對該酶分離提純,還通過基因工程將該酶基因表達在大腸桿菌和植物體內。但研究較多集中在乙醛脫氫酶的分離提取、基因多態性以及其與疾病的相關性方面,并未見將乙醛脫氫酶制成預防和治療各種相關疾病 (像酒精性疾病)的藥品或保健品的報道,也未見其在工業上應用的報道。

由于ALDH的廣泛作用,它必將受到研究者的日益關注。隨著新的分離純化技術出現,ALDH將會得到更好的分離,屆時它的用武之地將會大大擴展。

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Research Progress of Aldehyde Dehydrogenase

MAO Gen-nian＊,L IXin,QU Jian-bo
College of life Science&Engineering,Shanxi University of Science&Technology,Xi'an,710021,China

R284.2

A

1001-6880(2011)01-0193-05

2010-03-16 接受日期:2010-06-17

陜西省自然科學基金項目 (SJ08B18);陜西省教育廳專項科研計劃項目 (編號 08JK236)

＊通訊作者 E-mail:maogn@sust.edu.cn