針刺和神經干細胞聯合治療腦癱幼鼠的效果評價

付 強，祁巖超*，唐純志，劉振寰，林世堅，唐鴻生

（ 1.廣州醫學院附屬腫瘤醫院實驗中心，廣東 廣州 510095；2.廣州中醫藥大學針灸推拿學院，廣東 廣州 510405；3.佛山市南海區婦幼保健院，廣東 佛山 528200）

腦性癱瘓（cerebral palsy，CP）是小兒先天性或圍產期所發生的腦功能障礙性綜合征，是繼脊髓灰質炎被控制后近代最常見的兒童致殘性疾病[1]。針刺作為中醫治療中的一枝奇葩在治療小兒腦癱方面有著不錯療效[2]。但完全治愈率僅5%左右。本實驗通過針刺和神經干細胞聯合治療腦癱幼鼠，以探討其協同作用對其學習記憶能力和腦內神經再生的療效，最大限度地改善其學習記憶能力和肢體運動能力。為臨床應用提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 試劑和儀器

DMEM/F12培養基和B27（GIBCO）公司；堿性成纖維細胞生長因子（basic f broblast growth fact，b FGF）、表皮生長因子（epidermal growth fact，EGF）（GIBCO）。溫室一/二抗（自配）。主要儀器有：G6805-1電針治療儀（中國青島鑫升實業有限公司），Y迷宮（河南省原陽縣振華教育儀器廠），BX50生物組織顯微鏡（Olympus），免疫熒光顯微鏡（Olympus）。

1.2 實驗動物及分組

清潔級健康新生SD幼鼠40只（體質量＞12 g），由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供。隨機選取8只作為正常對照組（正常組）；成功模型隨機分成以下3組，每組8只：模型組、單純針刺組、腦癱+NSC移植治療組。

1.3 方法

1.3.1 HIBD動物模型制作參照文獻[4]用乙醚淺麻醉幼鼠，分離左頸總動脈并結扎（模型組、治療組），縫合切口后放入37℃恒溫水浴容器中恢復2 h，然后密閉容器，以1 L/min的速度通入8%氧氣+92%氮氣的混合氣體，2.5 h后取出，1 h后作行為測定。翻身不能，平衡異常和左旋者視為成功模型，并返回鼠籠中飼養。

1.3.2 針刺部位：參考《實驗針灸學》[5]，結合人與動物骨類比，選取百會，顳1針，曲池，內關，足三里，涌泉。 方法：以直徑0.2 mm，長20 mm的華佗牌針刺針，頭部穴位平刺，進針后覺針下沉緊即可，百會、顳1針接G6805-II電針儀，連續波，頻率5～10 Hz，以頭部輕微抖動為度，約3～5 V，持續10 min。曲池，足三里穴針1分針深左右，電針同上。內關、涌泉速刺微出血，不留針。每天一次，共21 d。

1.3.3 神經干細胞的分離培養及鑒定參照宣愛國等的培養實驗方法[6]取新生SD大鼠（＜24 h），在無菌條件下分離出海馬，制成單細胞懸液，加入含B27、表皮生長因子（EGF）和堿性成纖維細胞生長因子（FGF-2）的DMEM/F12培養基。鏡下觀察，待原代克隆形成后機械分離成單細胞懸液，按上述條件繼續培養。以后每5～7 d分離克隆傳代1次，方法同前。神經干細胞鑒定細胞過程：培養的干細胞加入包被POLYL-Lycine的6孔板，PBS洗2次，10 min/次。4%多聚甲醛固定20 min。0.01mPBS洗2次，每次5 min。0.01 mPBS+0.2% tritonx-100穿透30 min。0.3%～0.5%二抗宿主血清（山羊血清）封閉60 min。室溫一抗（nestin 1︰500；GFAP 1︰500，Tuj-1 1︰100，O4 1︰200分孔加入6孔板）孵育2 h，或4℃過夜，濕盒保溫。0.01 mPBS+0.2% tritonx-100或PBS洗滌3次，每次3 min。室溫二抗生物素標記物（或FITC標記山羊抗小鼠）孵育60 min（1︰200）用濕盒保存，此時避光操作。0.01 PBS洗滌3次，每次10 min。用DAPI（一種熒光染料，呈藍色）或heochst染核10～30 min。0.01 PBS洗滌10 min 1次。用緩沖甘油封片，熒光或共聚焦顯微鏡觀察。

1.3.4 海馬組織病理形態學檢測（HE染色法）組織經10%中性緩沖福爾馬林固定，常規包埋，石蠟切片4 UM，二甲苯兩缸脫蠟各6 min，無水乙醇洗脫二甲苯1 min χ2次，95%、90%、85%酒精各1 min，自來水漂洗2 min，蒸餾水浸洗1 min，蘇木精染色3～5 min。自來水洗1 min。1%鹽酸酒精分化3 s。自來水洗1 min。1%稀氨水返藍30 s后，鏡下控制。自來水洗1 min。伊紅染色1 min。自來水沖30 s。85%酒精脫水30 s。90%酒精脫水30 s。95%酒精兩次脫水各2 min。無水乙醇兩次各2 min。二甲苯三次各2 min。中性樹膠封片。普通光鏡10×20倍下隨機觀察每張切片5個不同視野內腦缺血后病理變化情況，并計數正常神經比較低數目，取平均值。

1.3.5 腦皮質神經細胞凋亡檢測（TUNEL法）幼鼠腦組織經10%中性福爾馬林固定，常規脫水，石蠟包埋，切片厚4μ m。切片經純二甲苯脫臘二次，每次6分鐘。梯度乙醇脫二甲苯各2 min。自來水漂洗、PBS漂洗各3次，每次2 min，切片浸入0.1% Triton×100液室溫下處理8 min。流水沖洗2 min，入PBS洗1 min，3次。滴加轉換液37℃處理30 min。入PBS洗2 min，3次。BCIP-NBT顯色液鏡下控制顯色約10 min，流水沖洗3 min，入PBS洗2 min，3次。擦去組織周圍水分，GVA水溶性封片劑封片，室溫晾干。每張切片在10×20倍光鏡下隨機觀察每一組動物同一部位切片，選擇5個不重復視野進行觀察，并聯接圖像分析系統，測出每張切片5個不重復視野內全部正常神經細胞及凋亡神經細胞的數目，取其平均值，算出凋亡指數。

1.3.6 細胞移植 將以上培養的NSC神經球吹打成單個細胞，反復清洗后調細胞濃度為1×108，取2 μL，細胞為2×105。在日光燈照射下通過尾靜脈注射。隔天1次，共3周。

1.3.7 行為學實驗：（1）懸吊實驗 使幼鼠前腿抓住一水平的不銹鋼棒（直徑約5 mm）。離地面高約45 cm，以秒為計算單位，記錄幼鼠掉下的時間。時間越短說明肌力越好。（2）斜坡實驗，將幼鼠頭向下倒置于45℃斜面上，記錄幼鼠轉為頭向上135℃角度的時間，以秒為計算單位，記錄時間。時間越短說明隨意運動越好。（3）Y迷宮實驗電壓50 V～60 V，試驗前先將幼鼠放入迷宮中適應3～5 min，然后以無規則次序變換安全區。幼鼠受電擊后逃到安全區后，燈光繼續作用10～15 s。再以幼鼠所在支臂就作為下一次測試的起始位置進行下一次測試。記錄幼鼠從打開燈到逃到安全區所需時間。凡幼鼠受電擊后10 s內一次性從起步逃到安全區的反應稱為“正確反應”，否則為“錯誤反應”。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 行為學檢測

2.1.1 懸吊實驗結果（表1）。

表1 懸吊實驗結果

表1 懸吊實驗結果

注：各組與模型組相比★P＜0.01；針刺+NSC組與單純針刺組相比▲P =0.027＜0.01。

實驗分組 n 術后24 d正常組 8 59.27±1.58★模型組 8 26.19±13.61單純針刺組 8 131.2±11.79★針刺+NSC組 8 40.54±10.65★▲

2.1.2 斜坡實驗結果（表2）。

表2 各組幼鼠斜坡實驗結果 （

表2 各組幼鼠斜坡實驗結果 （

注：各組與模型組相比★P＜0.01。

正常組 8 12.29±1.25★模型組 8 25.57±7.12單純針刺組 8 19.31±8.25★針刺+NSC組 8 17.89±6.21★

2.1.3 Y迷宮實驗結果（表3）。實驗分組 n 正確次數

表3 各組幼鼠術后24 d Y迷宮試驗正確次數 （，秒）

表3 各組幼鼠術后24 d Y迷宮試驗正確次數 （，秒）

注：各組與模型組相比★P＜0.01；針刺+NSC組與單純針刺組相比▲P =0.015＜0.01。

正常組 8 19.27±1.13★模型組 8 19.15±2.15單純針刺組 8 13.16±1.32★針刺+NSC組 8 16.26±1.41★▲

2.2 組織學檢測

2.2.1 腦內海馬組織正常神經細胞數目（表4）。

表4 各組幼鼠海馬組織正常神經細胞數目（個/視野）

表4 各組幼鼠海馬組織正常神經細胞數目（個/視野）

注：各組與模型組相比★P＜0.01；針刺+NSC組與單純針刺組相比▲P =0.007＜0.01。

實驗分組 n 正常神經細胞數正常組 8 21.69±1.75★模型組 8 11.37±0.82單純針刺組 8 15.38±1.26★針刺+NSC組 8 17.15±1.22★▲

2.2.2 腦皮質內神經細胞凋亡指數（見表5）。

注：凋亡指數（apoptosis index, AI）是指每張TUNEL陽性切片中，選取5個陽性細胞數（細胞核中有棕黃色顆粒者）最多的高倍視野，計算其中陽性細胞所占的百分比。

表5 各組幼鼠腦皮質神經細胞凋亡指數（，%）

表5 各組幼鼠腦皮質神經細胞凋亡指數（，%）

注：各組與模型組相比★P＜0.01；針刺+NSC組與單純針刺組相比▲P=0.006＜0.01。

實驗分組 n 凋亡指數正常組 8 10.89±0.15★模型組 8 17.82±1.13單純針刺組 8 14.36±2.35★針刺+NSC組 8 11.79±1.43★▲

腦組織涂片：普通光鏡10×20倍下隨機觀察每張腦組織切片病理形態學變化情況：腦組織常規石蠟切片，HE染色后，神經細胞核呈藍黑色，胞漿呈淡紅色。（1）正常組皮層腦細胞結構正常，間質無水腫表現，胞漿豐富，胞核清晰可見，海馬錐體細胞2～3層，而且相鄰細胞間排列緊密，核仁清晰，細胞核圓而大。（2）模型組可見皮層變薄，部分神經元變性，體積變小，核固縮成三角形或不規則形，核仁消失，胞核與胞漿界限模糊。海馬錐體細胞層數減少，排列稀疏，不規則，細胞體積變小，可見核固縮現象。（3）單純針刺組、針刺+NSC組仍有不同程度的神經細胞變性，但變性神經細胞數量顯著減少，零星可見一些損傷細胞，海馬錐體細胞層細胞形態、排列基本正常。

3 討論

針灸治療腦癱已經得到國內外學者的共識，但其機制尚不清楚，可能是通過針刺的良性誘導，促進了一系列細胞因子的產生與釋放，從而改善了NSC所賴以生存的腦內微環境并進一步促進NSC增殖與定向分化，最終達到修復腦癱腦損傷的目的[7]。因此，可以認為針刺是促進了腦內源性NSC的增殖和分化。但僅內源性NSC不足以修復損傷的腦組織，外源性神經干細胞移植可解決這一難題，但仍存在較大的局限性，主要是轉化為神經干細胞的比率低，療效欠佳[7]。如果有針刺的干預，可能會使其整合到相應腦區繼續發揮作用。隨著對小兒腦癱研究的不斷深入，CP的治療手段逐漸增多。神經干細胞移植治療小兒腦癱成為目前的一種新的治療方向。本研究中我們將祖國傳統醫學精華-針灸療法加以改進，用現代神經干細胞技術，移植足量的NSC到SVZ區，即解決了針炙促進SVZ區NSC增殖數量有限的難題。又使外源性NSC轉化為神經元的效率盡可能得到提高。最終使腦癱治療的有效率和治愈率提高。本實驗研究結果證實，針刺和神經干細胞聯合移植對腦癱幼鼠的學習記憶能力、肢體運動能力以及腦組織細胞數量的維持和抑制凋亡均有顯著效果。

[1] 王維治.神經病學(第5版)[M].北京:人民衛生出版社,2007:279.

[2] 鐘玉濤,李勝吾.針刺治療小兒腦癱近況概述[J].吉林中醫藥, 2010,30(5).

[3] SnyderEY,YoonC,Flax JD,et a1.Muhipotent neural precursors Call differentiate to ward replacement of neurous undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex[J].Proc Natl Acad Sci USA,1997,9:I1 663-11 668.

[4] 張 敏,楊萬章,吳 芳,等.神經生長因子配合臍血源神經干細胞移植對腦癱患兒運動功能的影響[J].中國誤診學雜志,2008,8(23):5 596-5 598.

[5] 余曙光,郭 義.實驗針灸學[M].上海科技出版社,2009,1,1.

[6] 宣愛國,龍大宏,楊丹迪,等.神經干細胞和腦源性神經營養因子聯用對癡呆模型鼠基底前腦p75表達及其學習記憶能力的影響[J].解剖學雜志,2007,30(1):43-45.

[7] 劉 鄉,柴鐵劬,孫 娟,等.靳三針療法對窒息腦癱幼鼠神經干細胞增殖與分化的實驗研究[J].廣州中醫藥大學學報,2010:231-235.