表皮生長因子受體抑制劑對外源鋅離子致大鼠急性呼吸道炎癥的影響*

賈陳志,關文池,李 冰,梁 寧,燕 貞,王 威,吳逸明,吳衛東#

1)鄭州大學公共衛生學院勞動衛生學教研室鄭州 450001 2)廈門大學醫學院臨床醫學系廈門 361005

#通訊作者,男,1963年10月生,博士,教授,研究方向:分子毒理學,E-mail:wdwu98@gmail.com

大氣中鋅離子主要存在于微細顆粒物中,可以多種形式存在,主要包括硫酸鋅、氧化鋅和氯化鋅。環境流行病學調查結果[1-2]表明,長期吸入空氣中含鋅顆粒物與當地居民呼吸系統炎癥性疾病(如慢性支氣管炎、支氣管哮喘)發病率的升高有密切關系。實驗結果[3]顯示,含鋅化合物可提高人支氣管上皮細胞和肺泡上皮細胞內白細胞介素8(interleukin-8, IL-8)的表達。發生肺部炎癥的大鼠支氣管肺泡灌洗液(broncho-alveolar lavage fluid,BALF)中中性粒細胞、巨噬細胞和總蛋白含量升高[4]。外源鋅離子可激活呼吸道上皮細胞內多個信號傳導分子,如表皮生長因子受體(epidermal growth factor recep tor, EGFR)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-kinase-protein kinase B, PI3K-PKB)等[5]。但是這些信號傳導分子在鋅離子致呼吸道損傷過程中的作用還不清楚。課題組前期研究[6]觀察到外源性鋅離子有磷酸化(即活化)人呼吸道上皮細胞EGFR作用,因此推斷EGFR可能在鋅離子致呼吸道炎癥過程中發揮重要作用。為證實推論,作者進行了如下研究。

1 材料與方法

1.1 試劑 硫酸鋅(天津凱通化學試劑有限公司),EGFR抑制劑PD153035(美國Calbiochem公司),二甲基亞砜(DMSO,美國Sigma公司),IL-8、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)、ELISA試劑盒(美國RD Biosciences公司)。

1.2 實驗分組 實驗對象:13周齡清潔級健康雄性Wistar大鼠50只,體質量100～130 g,購自河南省實驗動物中心,合格證號scxk(豫)2005-0001。實驗分兩個階段。第一階段探討硫酸鋅引起大鼠急性呼吸道炎癥最明顯的時間點。30只大鼠采用隨機數字表分為 6組,每組 5只,大鼠先用乙醚麻醉,然后采用支氣管灌注法分別給予PBS或100μmol/L硫酸鋅溶液(灌注劑量1m L/kg),分別于灌注后4、8、24 h處死。第二階段探討預灌注PD153035對硫酸鋅作用的影響。20只大鼠隨機分為4組(分別用PD153035和硫酸鋅、PD153035和PBS、DMSO和硫酸鋅以及DMSO和PBS灌注處理),每組5只,先用DMSO或1 μmol/L PD153035溶液預灌注,灌注劑量0.5m L/kg,約30min后再按照同樣方法分別灌注PBS和硫酸鋅溶液。處理時間參考第一階段實驗結果。

1.3 呼吸道炎癥指標檢測方法 大鼠頸椎脫臼處死,每只用5m L生理鹽水進行肺灌洗2次,取BALF混勻,先進行白細胞計數,然后2 000 r/m in離心10 min,取上清液用于總蛋白(考馬斯亮藍法)、IL-8蛋白和LDH含量檢測。

1.4 統計學處理 采用SPSS 12.0進行分析。應用 2×3析因設計方差分析,比較不同灌注液及時間對大鼠急性呼吸道炎癥的影響,篩選最佳時間;應用2×2析因設計方差分析,比較預灌注液和灌注液的主效應及其交互作用。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 硫酸鋅對大鼠呼吸道各炎癥指標的影響 見表1。灌注硫酸鋅8 h時各炎癥指標均高于4 h和24 h。

2.2 EGFR抑制劑對硫酸鋅致大鼠呼吸道炎癥指標的影響 見表2。

表1 硫酸鋅對大鼠呼吸道各炎癥指標的影響(n=5)

表2 EGFR抑制劑對硫酸鋅致大鼠呼吸道炎癥指標的影響(n=5)

3 討論

EGFR廣泛分布于上皮組織中,參與呼吸道上皮細胞膜的修復等生理反應,在呼吸道炎癥發生過程中起重要調節作用[7],另外在肺癌組織中大量表達[8]。PD153035是EGFR酪氨酸激酶的特異性抑制劑,能選擇性地阻止 EGF介導的細胞有絲分裂、基因表達和細胞癌變[9]。

為闡明EGFR抑制劑對鋅離子誘發呼吸道炎癥的影響,研究者先制備大鼠呼吸道炎癥模型。由于硫酸鹽在細胞代謝和哺乳動物的發育過程中起重要作用,硫酸根離子維持著機體的酸堿平衡[10],且硫酸鋅是鋅離子在空氣顆粒物中主要的存在形式,因此研究者使用氣管灌注硫酸鋅的方法誘發動物呼吸道炎癥。結果顯示,BALF中各指標均較對照組明顯升高,以灌注 8 h最明顯,提示硫酸鋅可誘發大鼠急性呼吸道炎癥。

進一步用EGFR抑制劑PD153035(溶解于DMSO)預灌注大鼠呼吸道,并用DMSO為對照,在灌注硫酸鋅和PBS 8 h后觀察炎癥變化。研究結果顯示PD153035預灌注組各炎癥指標均比DMSO預灌注組減弱,提示 PD153035可明顯抑制硫酸鋅對大鼠呼吸道的炎性損傷作用。至于硫酸鋅是通過何種機制激活EGFR以及EGFR又是通過何種機制介導硫酸鋅的炎癥作用,尚有待深入研究。

綜上所述,呼吸道灌注硫酸鋅可誘發大鼠呼吸道急性炎癥,EGFR抑制劑PD153035能夠有效抑制硫酸鋅誘發的呼吸道急性炎癥。

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