原發性肝癌組織中SOX7mRNA的表達*

翟倩倩,岳素文,張 玲,黃長山,崔 宏,王永峰,陳香梅,呂全軍#

1)鄭州大學公共衛生學院營養與食品衛生學教研室鄭州 450001 2)河南省腫瘤醫院肝膽外科鄭州 450008 3)北京大學醫學部病原微生物學系 北京 100191

#通訊作者,男,1962年10月生,博士,教授,研究方向:營養與疾病,E-mail:lqjnutr@zzu.edu.cn

世界范圍內,原發性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的發病率位居惡性腫瘤第5位,死亡率居第 2位,僅次于肺癌,該病缺乏有效的治療措施并且易復發。我國年死于肝癌的人數占全世界肝癌年死亡總數的55%[1]。HCC的發生和發展是一個多因素、多階段、多基因變異累積的復雜過程。染色體8p23.1和8p22上基因的缺失在肝癌中多有發生[2]。Wnt通路負性調控因子SOX 7基因的整個啟動子區及編碼區均位于8p23.1區域內。SOX7的異常低表達與包括結腸癌、乳癌及前列腺癌在內的許多腫瘤的發生發展密切相關[3-4]。作者采用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)法檢測了肝癌細胞系及HCC組織中SOX7mRNA的表達情況,并分析了其與HCC臨床病理特征之間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系 7種肝癌細胞系HepG2、SNU449、SNU182、SMMC-7721、HUH-7、PLC-PRF-5及Hep3B由北京大學病原微生物學教研室提供。7種細胞于含體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640培養液、37℃及含體積分數 5%CO2的培養箱中培養,2～3 d換液傳代一次。

1.1.2 標本來源 收集河南省腫瘤醫院 2009年 5月至2010年4月40例HCC患者手術切除標本,患者均有肝硬化,男性,年齡 35～76歲,＞45歲 32例。40例均取其癌灶及相應癌旁3～5 cm處正常組織。標本離體0.5 h內立即取材后放入液氮內凍存。按國際抗癌聯盟(UICC)提出的肝癌臨床分期TNM分類標準:Ⅰ期 11例,Ⅱ期 2例,Ⅲ期 27例;有門靜脈癌栓18例,無門靜脈癌栓22例;輕、中、重度肝硬化分別為 1、12和 27例;存在肝內播散 16例,無 24例。所有標本的取用均征得患者同意,均經術后病理學確診,患者術前未接受過放化療。

1.2 SOX 7 mRNA的檢測 Trizol試劑(Invitrogen公司),逆轉錄試劑盒(Fermentas公司),Real-time PCR試劑及儀器(德國Roche公司Light Cycler 480 SYBR Green IMaster)。Trizol法提取組織和細胞系總RNA,再按照逆轉錄試劑盒說明逆轉錄成cDNA,于-20℃冰箱中保存備用。以cDNA為模板,HMBS為內參,采用Real-time PCR對SOX7 mRNA進行擴增。SOX7和HMBS引物序列見表1。擴增體系20 μL,其中羅氏Mix 10μL,上下游引物各0.5μL,雙蒸水8μL,cDNA 1μL。反應條件:95℃預變性10min; 95℃變性 30 s,60℃退火 30 s,72℃延伸30 s,84℃15 s采集熒光,40個循環;最后70℃延伸7min。每個樣本重復2個復孔,取2次循環次數(Ct)的平均值作為終值。Ct值是指產生的熒光量超過一個固定閾值時的循環次數。SOX7 mRNA表達水平=2-ΔCt, ΔCt=Ct(SOX7)-Ct(HMBS)。癌組織與相應正常組織中SOX7mRNA表達水平的比值＜0.5為低表達, 0.5～2.0為無差異,＞2.0為高表達[5]。

表1 引物序列

1.3 統計學處理 采用SPSS 16.0進行統計分析,癌和正常組織SOX7mRNA表達水平的比較采用配對t檢驗,不同臨床病理特征癌組織中SOX7 mRNA表達的比較采用秩和檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 肝癌細胞系中SOX 7m RNA的表達情況 以SOX7mRNA在7例正常肝組織中表達水平的平均值為1,對7株肝癌細胞系中SOX7mRNA的表達水平進行校正,結果表明HepG2、SNU449、SMMC-7721和HUH-7中SOX 7 mRNA的表達水平分別為0.061、0.057、0.032和0.025,SNU182、PLC-PRF-5和Hep3B中則檢測不到SOX7mRNA的表達。

2.2 HCC和正常組織中SOX7 mRNA的表達情況 HCC組織中SOX7 mRNA的表達水平為(1.189±1.213),低于正常組織的表達水平(1.821±1.718)(t=2.040,P=0.048)。HCC組織中SOX7 mRNA低表達19例(47.5%),與正常組織表達無差異17例(42.5%),高表達4例(10.0%)。

2.3 不同臨床病理特征HCC組織中SOX 7 m RNA的表達 見表2。

表2 不同臨床病理特征HCC組織中SOX 7mRNA的表達 例

3 討論

經典Wnt信號通路也稱為Wnt/β-catenin信號通路,是一條極其保守的信號轉導通路,存在于從線蟲到人類的各種動物體內,參與胚胎發育及細胞增殖與分化等正常生理過程[6],其異常持續激活與許多腫瘤的形成有關,包括腦瘤、乳癌、結腸癌、皮膚癌、肺癌、腎癌和肝癌等[7]。SOX基因家族是Wnt信號通路重要的轉錄調控因子,參與性別決定、性別分化、神經發生、軟骨形成以及胸腺細胞的分化等過程[2]。SOX基因根據HMG盒基因序列的同源性分為10個亞組,SOX7是SOX家族F亞組的成員之一。當Wnt分子存在,開啟Wnt/β-catenin信號通路導致β-catenin在細胞質內積聚,隨后轉移入細胞核時,SOX 7通過直接與TCF/LEF競爭結合β-catenin,從而抑制TCF/LEF/β-catenin介導的Wnt信號通路下游靶基因的激活[6]。或者當β-catenin在細胞質內積聚時,SOX7通過促進β-catenin突變,使其在胞質中被GSK-3β、Axin和APC組成的降解復合體磷酸化,隨后經泛素化途徑被蛋白酶體識別并降解,從而抑制 Wnt信號通路的激活[8]。已有研究[2-3,9]報道,SOX7低表達與許多人類腫瘤(如前列腺癌、結腸癌、原發性乳癌、原發性腎癌及原發性肺癌等)的發生發展有關。

該研究結果顯示,HepG2、SNU449、SMMC-7721及HUH-7肝癌細胞系中SOX7 mRNA的表達水平低,SNU182、PLC-PRF-5及Hep3肝癌細胞系中則檢測不到SOX7mRNA的表達。作者進一步研究發現,與正常肝組織相比,SOX7 mRNA在47.5%(19/40)的HCC組織中低表達;HCC組織的臨床分期越高, SOX7mRNA的表達水平越低。說明HCC組織中SOX7mRNA低表達,且與HCC病情惡性程度有關。

SOX7基因在肝癌中表達缺失,可能導致 βcatenin在核內積累。有研究[10-11]證實,正常肝組織中β-catenin表達位于細胞膜上,細胞質內有弱表達,無核內表達;而肝癌組織中β-catenin則可以在細胞質或細胞核中表達;β-catenin在胞膜、胞質中的表達多見于高、中分化肝癌,核表達多見于中、低分化肝癌。β-catenin在核內可結合轉錄因子TCF/ LEF,介導靶基因c-myc、cylinD1轉錄,促進腫瘤細胞增殖[12]。SOX7基因在HCC組織中表達異常,可能通過β-catenin間接參與肝癌細胞的去分化過程及肝癌細胞增殖和病情惡化。

綜上所述,肝癌細胞系和HCC組織中SOX7 mRNA表達水平下調,且與HCC的惡性程度有關,但SOX7與Wnt信號通路的關系及兩者在HCC發生、發展中的作用機制還有待進一步研究。

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