氯通道電流在離體大鼠海馬缺血缺氧性神經元凋亡中的變化及SITS的拮抗作用*

鐘志超,范洪領,尹金寶,鄭原印,許黎娟,常全忠

遵義醫學院珠海校區生理學教研室珠海 519041

#通訊作者,男,1965年12月生,博士,教授,研究方向:神經生物學,E-mail:cqzchang@tom.com

在缺血性腦損傷和多種神經系統退行性疾病中,腦細胞的程序性死亡是腦功能退化和損傷的主要誘因[1]。目前對缺血性腦損傷后神經元程序性死亡的機制尚不完全清楚。研究[2]發現,腦缺血后海馬CA1錐體細胞膜的興奮性持續降低是觸發遲發性神經元死亡的一個重要因素,這種興奮性的改變可能與氯通道的活動增強有關。陰離子通道阻斷劑DIDS對容積敏感性氯通道有明顯的阻斷效應并具有明顯的抗凋亡作用,且具有劑量依賴性[3-4]。對氯通道在缺血缺氧性神經元凋亡中的作用目前報道較少。作者利用NO誘導大鼠海馬神經元損傷,觀察神經元膜氯通道電流的變化及氯通道抑制劑 4-乙酰氨基-4'-異氰酸芪-2,2'-二磺酸(SITS)對電流的影響,探討氯通道與缺血缺氧性腦神經元凋亡之間的關系。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑 新生1 d的SD大鼠由遵義醫學院實驗動物中心提供;DMEM/Ham's F12培養基以及多聚賴氨酸(PLL)、阿糖胞苷、SITS、3-嗎啉斯德酮胺(SIN-1)等試劑購自美國Sigma公司;胎牛血清(杭州四季青公司)。

1.2 大鼠海馬神經元的培養 參照文獻[5]取出生1 d內的SD大鼠,雌雄不拘,無菌斷頭取腦,在冰冷D-Hank's液里分離雙側海馬,剪成約1 mm3小塊,2.5 g/L胰蛋白酶37℃消化15 min,加基礎培養基終止消化,機械吹打分散細胞,500目篩網過濾,制成單細胞懸液,1 000 r/min室溫離心10 min,去上清液,加完全培養基,吹打分散細胞后制成 4× 108L-1的單細胞懸液,接種在預先包被有 PLL的培養板內,于體積分數95%O2、5%CO2,37℃飽和濕度下培養,培養液中含有體積分數90%DMEM/ F12、體積分數10%胎牛血清、2mmol/L谷氨酰胺以及1×105U/L青、鏈霉素。接種 48 h后更換培養液,同時加入1×10-5mmol/L阿糖胞苷作用48 h,以抑制膠質細胞的過度增殖。以后每 3 d更換培養液 1次,每次更換原液體的 1/3。

1.3 實驗分組及處理 取培養 12 d的海馬神經元,隨機分為正常對照組、SIN-1處理組和SIN-1處理后加SITS組(SITS組)。SIN-1的作用終濃度是1.0mmol/L,作用時間是18 h,SITS(0.5mmol/L)的作用時間是18 h。

1.4 細胞凋亡檢測 采用Hoechst33258 DNA熒光染色法。取各組培養神經元,用0.1 mol/L pH 7.4的PBS沖洗1次,40 g/L多聚甲醛固定15 min,空氣干燥5 min,DNA熒光素Hoechst33258染色15 min,用0.1mol/L pH 7.4的PBS沖洗2次,倒置熒光顯微鏡觀察細胞核形態,每次數 3個高倍視野內200個細胞,計算細胞凋亡率。實驗重復 6次。

1.5 氯通道電流的檢測 采用全細胞膜片鉗技術,所需的主要液體配制方法如下。標準電極外液(SES):NaCl 110 mmol/L,CdCl22.0 mmol/L, EGTA 0.1 mmol/L,TEA-Cl 5.0 mmol/L,D-glucose 10mmol/L,HEPES 10 mmol/L,TTX 0.1μmol/L。用NaOH調節pH至7.3～7.4。標準電極內液(SIS):TEA-Cl 115 mmol/L,Na2-ATP 2.0 mmol/L, EGTA 1.0 mmol/L,MgCl21.0 mmol/L,CaCl21.0 mmol/L,D-glucose 10 mmol/L,HEPES 10 mmol/L。調節pH至7.3～7.4。

1.6 統計學處理 采用SPSS 11.0進行分析,3組間神經元凋亡率的比較用單因素方差分析,兩兩比較采用SNK-q檢驗,檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 3組神經元的形態學觀察 見圖1。對照組神經元胞核呈卵圓形,熒光顯微鏡下呈均勻的藍色熒光。SIN-1組神經元大量凋亡,凋亡的神經元皺縮或變圓、染色質濃集或斷裂或出現凋亡小體,呈強亮的藍色熒光。SITS組凋亡神經元明顯少于SIN-1組。凋亡率測定結果見表 1。

圖1 3組離體培養海馬神經元的形態學變化(DNA熒光染色,×400)

表1 各組神經元凋亡率比較 %

2.2 3組海馬神經元氯通道電流檢測結果 正常情況下氯通道電流隨膜的逐漸去極化由負值向正值變化,從膜電壓-100 mV的(-8.19±1.92)A/F升到膜電壓+80 mV的(22.46±1.50)A/F,變化趨勢呈外向整流特性,膜反轉電位約為-70 mV,大致接近氯離子的膜平衡電位;膜電流的變化呈電壓依賴性,與時間關系不大。浴槽液中加SIN-1(終濃度為1.0 mmol/L)作用10～15min可增加海馬神經元氯通道電流密度,從-100 mV的(1.46±0.20) A/F增加到+80 mV時的(23.22±1.89)A/F。SITS(0.5mmol/L)在浴槽液中作用5min能部分阻斷通道電流(圖2)。

圖2 3組海馬神經元氯通道電流檢測結果A:電壓變化曲線;B:電壓-電流密度曲線;1:對照組;2:SIN-1組;3:SITS組。

3 討論

缺血性腦損傷會引起腦內 NO的過量產生而引起毒性損傷作用。為模擬缺血性腦損傷神經元凋亡,作者用NO供體SIN-1誘導神經元凋亡。用DNA熒光試劑對核染色,結果顯示,正常離體培養12 d的海馬神經元胞核光滑,呈卵圓形,熒光顯微鏡下呈淡藍色熒光;SIN-1(1.0mmol/L)作用18 h,神經元胞核濃縮、變小,折射出強亮的藍色熒光,凋亡率明顯升高。提示使用SIN-1誘發缺血性腦神經元凋亡模型可靠。0.5mmol/L的SITS可明顯減少凋亡率,提示氯通道的活動可能參與了這種類型的神經元凋亡的發生。

氯通道在缺血性神經元凋亡中的作用國內外報道甚少。有報道[6],是氯離子而不是鉀離子參與了神經元凋亡的過程。在NMDA誘導神經元凋亡模型中,氯通道阻斷劑SITS和DIDS均可明顯減少神經元的凋亡率[7]。作者利用全細胞膜片鉗記錄模式觀察了在SIN-1處理前后、氯通道阻斷劑使用前后氯通道全細胞電流密度的變化。結果顯示:SIN-1處理神經元后能明顯增加氯通道的電流密度,這些電流的增加幾乎被氯通道阻斷劑SITS所阻斷,證實氯通道可能參與了SIN-1誘導的缺血性海馬神經元的凋亡。提示:在缺血性腦損傷中,腦內過量產生的NO可激活神經元上的氯通道,氯通道的活動增強可能參與了缺血性腦神經元的凋亡過程。氯通道是通過什么機制參與缺血性神經元的凋亡過程有待于進一步研究。

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