蛛網膜下腔神經阻滯麻醉對兔脊髓神經元形態及c-fos蛋白表達的影響

張 勇,李 霞,甘子明

1)新疆醫科大學第五附屬醫院麻醉科烏魯木齊 830011 2)新疆醫科大學基礎醫學院解剖學教研室烏魯木齊 830011

△男,1963年8月生,碩士,副主任醫師,研究方向:外周神經阻滯麻醉對脊髓神經的生物學影響,E-mail:maiker123@163.com

周圍神經阻滯麻醉方法簡單,效果良好,對全身的生理干擾少,且經濟,因此在臨床上被廣泛應用。人的感覺是通過神經反射傳導到大腦皮質來實現的。簡單神經反射由感受器、傳入神經、低級中樞(脊髓)、傳出神經和效應器組成;復雜神經反射則由低級中樞向高級神經中樞傳導整合而完成。作者采用新西蘭大白兔制備蛛網膜下腔阻滯麻醉(腰麻)模型,觀察兔相應節段脊髓神經元形態的變化及c-fos蛋白的表達情況,探討周圍神經阻滯麻醉對脊髓形態和功能的影響,以指導臨床麻醉的實踐。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選用健康新西蘭大白兔30只,雌雄不限,分籠飼養,由新疆醫科大學實驗動物中心提供,體質量3.0～4.0 kg,置于安靜、溫暖(20～23℃)、避強光的環境中飼養2 d。采用隨機數字表將30只大鼠分為實驗組和對照組,每組15只。

1.2 動物模型的建立 將兔以俯臥位固定于手術臺上,用20 g/L戊巴比妥鈉按30 mg/kg從兔耳緣靜脈注射麻醉。于 L5～6/L6～7棘突側緣進針穿刺到蛛網膜下腔,見腦脊液流出后,實驗組注射5 g/L布比卡因(上海禾豐制藥有限公司生產,產品批號: 070309)0.8m L,對照組注射生理鹽水0.8m L,溶液中均加2滴亞甲藍。麻醉后 30 min,將兔仰面固定在手術臺上,從胸骨左緣逐層切開,打開胸腔,暴露心臟,于心尖處用 12號針穿刺進入左心室,止血鉗固定;用組織剪打開右心房放血;向左心室快速靜脈注射生理鹽水500 mL,然后快速靜脈注射40 g/L多聚甲醛溶液1 000m L,清水沖凈后放到大白盤中。

1.3 脊髓神經元形態學觀察及c-fos蛋白檢測 解剖脊柱,分離腰骶干脊髓,并將其固定于40 g/L多聚甲醛溶液中。取 L5、L6和 L7節段脊髓,石蠟包埋,4μm厚橫切面切片。HE染色,顯微鏡下觀察各節段脊髓軟脊膜的改變,脊髓后角第Ⅲ、Ⅳ板層及脊髓前角第Ⅸ板層外側神經細胞形態(胞質尼氏體數等)的變化。用免疫組化SP法檢測脊髓神經元中c-fos蛋白的表達。免疫組化試劑盒購自北京中杉金橋生物技術有限公司,c-fos一抗試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司。c-fos陽性細胞胞質和胞核呈棕黃色顆粒樣著色;每張切片觀察5個高倍視野,每個視野計數 100個神經元中的陽性細胞數,取其平均數為該標本的陽性細胞數。

1.4 統計學處理 應用SPSS 11.0進行分析。對資料進行正態性和方差齊性檢驗,資料呈正態且方差齊,采用兩獨立樣本t檢驗分析2組兔脊髓神經元cfos蛋白表達的差異。采用確切概率法統計 2組家兔軟脊膜水腫分層的變化。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 2組兔脊髓神經元形態變化比較 見圖1。與對照組相比,實驗組脊髓灰質前角Ⅸ板層外側大多角細胞及后角Ⅲ、Ⅳ板層的小圓細胞胞質尼氏體減少,核偏向一端。實驗組脊髓軟脊膜有水腫、分層現象(12/15),對照組(2/15)沒有明顯變化(P＜0.001)。

2.2 2組兔脊髓神經元c-fos蛋白表達的比較 見圖 2。對照組脊髓灰質前角Ⅸ板層外側大多角細胞及后角Ⅲ、Ⅳ板層的小圓細胞有棕黃色顆粒陽性反應,密度分布均勻,色度較深,核仁濃縮呈深棕黃色, c-fos陽性細胞數為(68.9±1.4);實驗組陽性表達較弱(12.3±1.6)。2組比較差異有統計學意義(t=60.352,P＜0.001)。

3 討論

目前局麻藥產生神經阻滯的確切機制尚不清楚,在表面電荷學說、膜膨脹學說和受體部位學說中,以受體部位學說受重視。該學說認為,局麻藥是通過對神經細胞膜鈉通道的阻滯,使鈉通道失活來阻滯神經傳導。研究[1]證明,鈉通道是大分子糖基蛋白的雜三聚復合物,有 α、β1和 β2 3個亞單位,其中最大的 α亞單位是主要的功能單位,包括 4個相似的區段,每個區段由 6個螺旋結構的跨膜片段組成。局麻藥的作用位點是位于鈉通道細胞膜內側的 α亞單位第 4個區段的第 6個片段上的氨基酸殘基。

研究[2]報道,尼氏體的主要功能是合成蛋白質,包括復制細胞器和產生與神經遞質有關的蛋白質、酶類以及肽類神經遞質。當代謝功能出現障礙時,尼氏小體的形態可發生變化。神經元損傷、過度疲勞和衰老均能引起尼氏體減少、解體甚至消失。有文獻[3]報道,坐骨神經橫斷常致脊髓前角運動神經元發生軸突反應,形態上表現為尼氏體溶解,核偏位等改變。該實驗中,腰麻后實驗組 L5～7節段脊髓后角Ⅲ、Ⅳ板層小細胞及脊髓前角Ⅸ板層外側大多角細胞胞質中尼氏體減少,向外周移位,細胞核偏向一端。對照組脊髓神經細胞胞質尼氏體分布均勻,胞核無偏移。說明周圍神經阻滯麻醉后脊髓神經細胞功能受到抑制。

細胞受損,胞質尼氏體部分水解,損害不重時可以完全恢復。麻醉本身是一個可逆的過程,當麻醉結束時神經細胞內核向中心移位,尼氏體增多并重新分布在核周圍[4]。

此外,腰麻后軟脊膜有水腫、分層,而對照組軟脊膜無變化,提示局麻藥直接作用于脊髓軟脊膜后,軟脊膜有血管擴張、不同程度的水腫,故應嚴格掌握局麻藥的濃度和劑量。

正常生理情況下,多種細胞中均有c-fos基因的低水平表達,參與細胞的生長、分化和信息傳導等生理功能[5]。研究[6]證實各種傷害性刺激(包括疼痛、創傷和精神心理因素等)均可誘導多種組織細胞中c-fos基因的高表達,在一定程度上,c-fos基因被誘導的數量與所受刺激強度一致,且c-fos基因表達的數量和時程隨刺激強度、時間及性質而異。傷害性刺激誘導的c-fos在中樞神經系統中的表達多數情況下可被麻醉藥所抑制[7]。作者的實驗結果顯示,對照組 L5～7節段脊髓后角Ⅲ、Ⅳ板層的小細胞及脊髓前角Ⅸ板層外側大多角細胞中c-fos蛋白陽性細胞增多,而實驗組脊髓神經細胞c-fos蛋白表達不明顯。說明周圍神經阻滯麻醉后,脊髓神經細胞膜的鈉通道被阻滯,神經興奮的傳導被抑制,c-fos基因的誘導表達相應減少,進一步證明周圍神經阻滯麻醉抑制了脊髓神經細胞的功能。

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