河南漢族人群腫瘤壞死因子基因單核苷酸多態(tài)性檢測*

胡 灝,董獻(xiàn)紅,黃艷梅#,郭利偉,趙美樂,李 聰,王曉丹

1)新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院法醫(yī)物證學(xué)教研室新鄉(xiāng) 453003 2)河南正誠法醫(yī)臨床司法鑒定所鄭州 450008 3)河南省高級(jí)人民法院司法技術(shù)處 鄭州 450008

#通訊作者,女,1971年5月生,博士,副教授,研究方向:人類遺傳學(xué),E-mail:hym_cn@hotmail.com

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)是人體內(nèi)一種促炎細(xì)胞因子,具有廣泛的生物學(xué)活性。TNF基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphism,SNP)與疾病發(fā)生的關(guān)聯(lián)性已見報(bào)道[1-5],且有部分正常群體TNF基因SNPs等位基因頻率和家系的資料[3,6-7]。作者以河南漢族群體為研究對(duì)象,選擇TNF-α基因啟動(dòng)子區(qū)-238G→A(rs1800629)、-308G→A(rs361525)、-850C→T、-857C→T (rs1799724)、-863C→A(rs1800630)和TNF-β基因第一內(nèi)含子 +252G→A(rs909253)共 6個(gè)位點(diǎn)[2-5],應(yīng)用PCR-限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(PCR and restriction fragment length polymorphism,PCR-RFLP)檢測這6個(gè)SNPs位點(diǎn)等位基因分布頻率,并探討其在法醫(yī)學(xué)應(yīng)用中的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 遵循知情同意原則,收集河南漢族無親緣關(guān)系的體檢健康個(gè)體血樣 217份,3宗二代家系(父母子)血樣共9份。

1.2 TNF基因6個(gè)SNPs位點(diǎn)的PCR-RFLP分型取外周靜脈血3 mL,EDTA抗凝,常規(guī)苯酚-氯仿抽提法提取基因組DNA,用紫外分光光度計(jì)測定其含量。-20℃保存。

1.2.1 PCR反應(yīng)體系及熱循環(huán)參數(shù) 用于擴(kuò)增TNF基因6個(gè)SNPs位點(diǎn)的引物由Invitrogen公司(上海英駿生物技術(shù)有限公司)合成,引物序列見表1。PCR反應(yīng)體系:總體積為25μL,含10×buffer 2.5μL、25mmol/LMg2+1.5μL、2mol/L dNTP 1.0 μL、10mmol/L Primers 2.0μL、Taq DNA聚合酶1 U、基因組DNA(10～100 ng)3.0μL、ddH2O 14.6 μL。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性30 s,55℃退火 45 s,72℃延伸 45 s,36個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min。

1.2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物篩選及酶切產(chǎn)物分型 6個(gè)SNPs位點(diǎn)的限制性酶切位點(diǎn)見表1。于PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中加入相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切,酶切反應(yīng)體系:PCR產(chǎn)物5μL,內(nèi)切酶2 U,10×酶切緩沖液1μL,純水補(bǔ)足至總體積 10μL。37℃水浴 16 h。酶切產(chǎn)物用 150 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠垂直電泳進(jìn)行檢測,250 V 3～4 h。以未酶切的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作內(nèi)參。6個(gè)SNPs位點(diǎn)各等位基因判斷方法見表1。

表1 6個(gè)SNPs位點(diǎn)的擴(kuò)增引物序列、內(nèi)切酶及等位基因判斷方法

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SHEsis軟件[8]進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡χ2檢驗(yàn)及單體型分析;等位基因和基因型頻率、多態(tài)信息含量(polymorphic information content,PIC)、雜合度(heterozygosity,H)、個(gè)人識(shí)別率(probability of discrim ination power,DP)、非父排除概率(excluding probability of paternity,PE)等用PowerStats V12軟件(Promega生物技術(shù)有限公司研發(fā))計(jì)算[9]。基因多樣性(gene diversity,GD)或單體型多樣性(haplotype diversity,HD)=[(1-/(n-1)[10];組合基因型類型用Excel表格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 河南漢族TNF基因6個(gè)SNPs位點(diǎn)等位基因及基因型頻率分布 見表2。河南漢族人群TNF基因6個(gè)SNPs位點(diǎn)基因型均分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律。

2.2 TNF基因6個(gè)SNPs的組合基因型及其單體型估計(jì)結(jié)果 見表3、4。TNF基因6個(gè)SNPs的組合基因型在河南漢族群體 217人中檢測出57種類型(表3),H為 0.807。該群體中單體型估計(jì)有 25種,PIC為0.857,HD為0.894。

2.3 河南漢族TNF基因6個(gè)SNPs位點(diǎn)法醫(yī)學(xué)應(yīng)用參數(shù)及其家系調(diào)查結(jié)果 見表 5、6。將河南漢族人群6個(gè)TNF基因SNPs位點(diǎn)應(yīng)用于3個(gè)家系中,子代基因型符合孟德爾遺傳規(guī)律。

表2 TNF基因6個(gè)SNPs位點(diǎn)的等位基因及基因型頻率

表3 TNF-α238/α308/α 850/α857/α863/β252組合基因型估計(jì)結(jié)果

續(xù)表3

表5 河南漢族人群TNF基因6個(gè)SNPs位點(diǎn)的法醫(yī)遺傳學(xué)參數(shù)

表6 TNF基因6個(gè)SNPs位點(diǎn)的組合基因型在 3個(gè)家系中的分布

3 討論

法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別主要是應(yīng)用短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandem repeats,STR)分型技術(shù)[11],其遺傳標(biāo)記是核心序列為 2～6個(gè)堿基的串聯(lián)重復(fù),分型技術(shù)成熟,應(yīng)用廣泛。隨著第三代遺傳標(biāo)記SNP位點(diǎn)的興起,應(yīng)用SNP位點(diǎn)分型技術(shù)進(jìn)行法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別已見報(bào)道[12-14]。SNP分型應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)檢案的優(yōu)越性已經(jīng)越來越明確[12],但仍有必要對(duì)大量個(gè)體進(jìn)行基因分型,以找到必要的特異性位點(diǎn)[13]。

作者研究了河南地區(qū)漢族人群的6個(gè)TNF基因SNPs位點(diǎn),發(fā)現(xiàn)這6個(gè)SNPs位點(diǎn)等位基因頻率的分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,而且等位基因最小頻率均＞5%,說明這6個(gè)SNPs位點(diǎn)均具有遺傳多態(tài)性。利用等位基因頻率在 20%～80%的 SNPs標(biāo)記構(gòu)建高密度的遺傳圖譜效果較好[13-14],而這 6個(gè)位點(diǎn)中有 2個(gè)位點(diǎn)(TNF-β+252和TNF-α-857)的等位基因頻率在上述范圍內(nèi),作為候選SNPs應(yīng)用于法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)更有意義。

對(duì)于法醫(yī)學(xué)應(yīng)用而言,H、GD、PIC、PE和DP等是評(píng)價(jià)一個(gè)或一套遺傳標(biāo)記應(yīng)用價(jià)值大小的主要指標(biāo)。作者研究的TNF基因上6個(gè)SNPs位點(diǎn)單個(gè)SNP的各項(xiàng)法醫(yī)遺傳學(xué)參數(shù)(H、PIC、PE和DP)值相對(duì)較低,尚不能達(dá)到法醫(yī)學(xué)個(gè)人識(shí)別和親子鑒定的要求,但是根據(jù)6個(gè)SNPs位點(diǎn)構(gòu)成了57種組合基因型,并推測出25種單體型,PIC為0.857,GD為0.894,說明6個(gè)SNPs位點(diǎn)聯(lián)合應(yīng)用,其多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單一位點(diǎn)。這6個(gè)SNPs位點(diǎn)不僅位于同一條染色體上,而且距離不遠(yuǎn),符合法醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)對(duì)于SNPs的篩選原則[14]。

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